环介导等温扩增技术(LAMP)在肉源性检测中的应用及前景展望

娄宇飞， 魏昌盛， 胡瑞芳， 王洪宝， 昝林森

(西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

从2013年初欧盟的“马肉风波”开始，国内相继爆出了“牛肉香精假牛肉”、“鸭肉冒充羊肉”等一系列肉类制品原材料掺假案件。仅2013年3月，内蒙古包头腾达食品有限公司制售假劣食品案，案值便达600余万元，其生产的假劣牛肉干、羊肉干销往全国15个省区市，足可见掺假肉在全国乃至全世界的“盛行”。现阶段，肉类鉴别技术依旧以普通PCR和荧光PCR为主，但是由于实验仪器昂贵且体积较大，这些方法只能局限于实验室中，无法满足市场上对于快速、简便鉴别的要求。

2000年，日本荣研株式会Notomi等人[1]提出了一种名为LAMP的新型核酸扩增技术，由于其灵敏度高，特异性强，时效快，操作简单等优势迅速应用于食源性微生物的检验。之后经过Nagamine等人[2]的改进，迅速受到了广泛的关注，目前被广泛应用于病原微生物[3-5]、胚胎性别鉴定[6-7]等方面。近年来，其在肉类源性检验中的应用也越来越受到重视。

1 LAMP技术的原理

相关研究显示，DNA在65 ℃左右时，处于一种动态平衡中[8]，DNA在此温度下利用4条特异性引物依靠一种链置换DNA聚合酶，使链置换DNA的合成不停地自我循环。LAMP就是利用这种特性，在Bst DNA聚合酶和特异性引物的作用下以双链DNA为模板，在等温条件下完成DNA的合成和扩增[9]。

最初Notomi等人设计的LAMP仅有4条特异性引物，包括2条内引物(forward inner primer，FIP和backward inner primer，BIP)和2条外引物(forward outer primer，F3和backward outer primer，B3)，之后Nagamine等人在此基础上添加了2条环引物(loop-forward inner primer，L-FIP和loop-backward inner primer，L-BIP)，等温扩增的速度明显加快(可在10～15 min内完成检测)，并大大提高了检测效率(高出7个数量级)。

LAMP可分为2个阶段。第一阶段，DNA合成：首先FIP和BIP启动链置换合成，接着F3和B3先后结合到靶基因上，形成LAMP扩增的初始结构——环状哑铃结构，在此过程中，环引物的存在加快了核苷酸的延伸速度。第二阶段，循环扩增阶段：以自身3’末端的Fl 区域为起点，以第一阶段形成的环状哑铃结果为模板开始新的一轮置换反应，进行DNA扩增，最后形成一系列大小不一的结构，因此LAMP的凝胶电泳会出现多条扩增带，具体原理见图1。

图1 LAMP原理图[9]

2 LAMP在技术上的优势

目前，在肉类源性检验中有两大方向，一类是基于蛋白质水平的检测，如酶联检测法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[10-11]，但由于蛋白质易于变性，易导致检测失败，尤其是在食品加工的过程中，因此这种方法适用范围较窄，并且需要昂贵的仪器设备；另一种是基于DNA水平的检测，例如：普通PCR[12]、多重PCR(Multiplex PCR)[13-14]、种特异性PCR(species-specific PCR)[15]、实时荧光PCR(quantitative real-time PCR)[16]等。与这些方法相比，LAMP法具有以下明显的特点：

(1)灵敏度高。根据Li等人的研究表明，LAMP法的准确性与qPCR相当[17]，扩增模板可低至10拷贝亦或更少[18]。

(2)特异性强。最初的LAMP仅有内引物和外引物4条，改进后LAMP增加了2条环引物，只有当模板链中6个特异性区段全部匹配时才能扩增，因此在提高反应速度的同时极大地提高了鉴别的特异性。

(3)检测速度快，结果直观可视化。整个LAMP扩增在1 h内即可完成，产率可达0.5 mg/mL，引物进一步改进下，扩增时间可在原基础上减少1/3～1/2；DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼可视化观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。

(4)成本低，不需特殊仪器。无论是普通PCR还是多重PCR，都离不开PCR仪，因此只能在实验室环境中进行，但LAMP仅需要给予恒定的温度即可反应，无需特殊的仪器，极大地降低了成本，同时满足了市场对于快速、简便的需要。

3 LAMP在肉类鉴别中的应用

3.1 LAMP在检测猪源性成分中的应用

猪肉是目前市场上最常见的掺假成分，在羊肉、牛肉等产品中均有检出。为了更好保护消费者权益，研发快速检测掺假的方法势在必行，原则上说，使用鸭肉、猪肉等肉掺假制成的肉制品对人体没有太大的危害，但如果来源不明，携带致病菌就有可能危害人类健康。从宗教信仰角度来看，鉴别清真食品中的猪源性成分也有助于进行清真认证，更好地保护宗教信仰。

目前，LAMP技术在国内外肉源性检测方面已有广泛应用。2010年，Ahmed等[19]使用LAMP和disposable electrochemical printed(DEP)芯片来鉴别加工猪肉、鸡肉和牛肉中肉源性。与多重PCR(M-PCR)相比，此法更具特异性，并且检测精度更高。

2013年，杨丽霞等人[20]利用LAMP技术，以猪线粒体COXI基因为靶标设计特异性引物，对扩增产物进行凝胶电泳和终点染色，并采用荧光检测仪实时监控反应过程，证实了LAMP可以特异的检测出牛羊肉中的猪源性成分。在此基础之上，张英等人[21]对LAMP的反应温度和反应体系进行了优化，实验表明在三磷酸脱氧核苷酸 (dNTPs) 浓度为1.2 mmol/L，MgSO4浓度为4.0 mmol/L，甜菜碱浓度为0.8 mol/L，反应温度为72 ℃，反应时间为55 min时，LAMP反应效率最高，荧光效果最好。

Roy等[22]于2016年LAMP与电化学发光(ECL)技术整合用于检测皮克级别不同肉种的序列特异性DNA，通过利用该技术，检测到猪肉的靶DNA低至1 pg/μL。此外，该技术应用于枯草芽孢杆菌DNA样品的检测，实现了10 pg/μL的检测限。2018年，唐善虎等人[23]进一步对猪的12S rRNA-tRNA Val基因进行分析并设计特异性引物，确定了LAMP体系中猪肉的检出上限为0.125%。

3.2 LAMP在检测牛源性成分中的应用

2016年，徐淑菲等[24]建立了牛源性成分LAMP检测方法。试验结果表明：LAMP方法的灵敏度比PCR方法高100倍，可达到5.408×10-2μg/μL，最快在10 min即可完成，反应迅速。同年，冼钰茵等[25]建立了肉及肉制品中牛源性成分的LAMP检测技术，对市售的9种生牛肉及3种熟肉类制品进行对比检测，结果表明对我国南方主要食用牛肉-水牛、北方地区主要食用牛肉-黄牛及高原地区牛肉源牦牛均具有较高特异性，灵敏度均高达0.1%。

2017年，Li等[26]采用LAMP进行物种特异性靶基因扩增，并在免疫层析条带(ICS)上进行分析，以快速直观地鉴定肉类。基于LAMP的ICS方法显示出良好的特异性，可重复，对于肉类混合物中的牛肉灵敏度达0.1%，整个检测过程可在50 min内完成。

3.3 LAMP在检测羊源性成分中的应用

2014年，朱珠等[27]根据羊线粒体中物种特异性序列设计引物，应用可视化环状等温扩增技术(vLAMP)对羊源性成分进行快速扩增及可视化判断，建立羊源成分人工污染的饲料模型，考察检测方法的灵敏度。结果表明，羊源性引物仅能够对羊源性成分产生特异性扩增，灵敏度高达0.001%。所建立的牛、羊源性成分现场可视化筛查方法用于饲料中牛、羊源性成分污染和食品掺伪的现场可视化检测。

2015年，李向丽等[28]建立肉制品羊源性成分的LAMP检测方法，对市售羊肉片、羊肉卷、羊肉串进行羊源性成分检测分析，对肉制品中羊源性成分的检测灵敏度达0.5%。SYTO-9荧光染料的荧光实时检测结果与SYBR Green I染料肉眼观察结果一致。调查发现，该批市售羊肉及制品中存在掺假现象，掺假率为34.5%。

2017年，宋涛平等[29]根据羊cyt B特异性基因分别设计LAMP引物，反应时加入荧光染料SYTO-9，在63 ℃条件下反应45 min，通过实时检测荧光强度判断反应结果，并进行实时监测。实时荧光LAMP方法对羊源性成分的检测灵敏度为10 pg。对熟肉制品中掺杂肉检测时，掺杂羊肉的检出限为0.01%。

3.4 LAMP在检测禽源性成分中的应用

2014年， Cho等[30]设计了针对物种特异性线粒体DNA的LAMP测定，并根据退火曲线分析产生的独特退火温度区分靶基因。因为退火温度对于物种识别是有效的，并且它与每个靶基因位点的核苷酸组成有关[31]。生肉和熟肉中LAMP测定的检测限(LOD)由10 pg/μL至100 fg/μL水平确定，并且原料和熟肉混合物中的LOD测定为0.01%～0.0001%水平。测定在30 min内进行，并显示出比PCR测定更高的灵敏度。这些新型LAMP分析为肉类的鉴别提供了一种简单，快速，准确和灵敏的技术。

4 LAMP在检测其他肉源性源性成分中的应用

4.1 LAMP鸵鸟肉源检测

2014年，出现了利用鸵鸟线粒体细胞色素b基因，将LAMP与实时荧光计结合的测定方法。该方法可用于直接在餐厅或零售层识别鸵鸟肉，而且可以使用煮熟的，油炸的和加香料的样品。该LAMP测定对于检测鸵鸟肉具有极好的灵敏度和特异性，开发的系统允许检测0.01%的鸵鸟肉产品，并且取样鉴定时间为15～20 min。

4.2 马肉源检测

2015年，Zahradnik等[32]开发了一种LAMP方法，用于特定检测加工食品中的马肉。该方法对马和驴肉显示出极高的特异性，该方法灵敏度为0.1 ng。在加工肉制品(香肠)中，该方法在26 min内检测到0.1%的马肉含量。值得注意的是，在各种商业马肉产品中，该方法未检测到血样品中的马肉，甚至PCR也无法检测到这些样品中的马源性成分，因此作者认为血中的mtDNA含量可能不足以支持LAMP反应。

4.3 狐狸肉源检测

2016年，刘少宁等[33]优化LAMP反应体系检测羊肉中的狐狸源性成分，检测灵敏度达到1.0%，即最低检测浓度为2×10-4ng/μL。

为了更加清晰地展示LAMP技术在各肉源性食品检测中的应用情况，笔者将已有研究汇总整理形成表1。

表1 LAMP在肉源性检测上的应用分析

5 小结与展望

环介导等温扩增技术是一门新兴的分子生物学检测技术，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速省时、易于检测等优点，但同时也存在着其原理复杂、实验设计要求高、引物设计复杂、扩增的靶序列长度需控制在300 bp以下等缺点。

其已广泛用于细菌、病毒和转基因食品等各种检测当中，在动物肉源性检测当中的应用逐渐受到关注，技术也不断地被优化和完善，有望开发出一系列肉类检测的便携试剂盒，用于识别和检测新鲜生肉、热处理和加工过的肉类、肉制产品和动物饲料中肉的种类和含量，成为识别肉类品种的快速、可靠、非常适合定量且经济实惠的检测方法，为我国食品检测试剂盒的发展开辟新的方向，应用前景广阔。