P37、P16、PAX-2在子宫内膜增生症中的表达及其意义

焦艳

[摘要] 目的 分析P37、P16、PAX-2在子宫内膜增生症中的表达及其意义。 方法 收集2012年12月～2017年8月河北省秦皇岛市妇幼保健院接受病理活检，并经病理组织学活检确诊为子宫内膜增生患者的病理组织标本，其中单纯型及复杂型子宫内膜增生标本31个、不典型子宫内膜增生组织标本30个;另选取30个正常子宫内膜组织标本作为对照。采用免疫组化SP法检测不同组织标本中P37、P16及PAX-2蛋白阳性表达率。 结果 正常子宫内膜组织中未见P37蛋白阳性表达，不典型增生症组织中阳性表达率高于单纯型或复杂型增生症，差异有统计学意义（P < 0.05）;不典型增生组织中P16蛋白阳性表达<单纯型或复杂型增生<正常子宫内膜组织，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;不典型增生组织中PAX-2蛋白阳性表达<单纯型或复杂型增生<正常子宫内膜组织，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 P37、P16、PAX-2在不典型子宫内膜增生中均有一定异常表达，值得进一步深入探究。

[关键词] P37;P16蛋白;PAX-2;子宫内膜增生症

[中图分类号] R711.74          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（b）-0084-04

[Abstract] Objective To analyze the expression and significance of P37， P16 and PAX-2 in endometrial hyperplasia. Methods From December 2012 to August 2017， in Qinhuangdao Maternal and Child Health Hospital， the pathological tissue specimens of patients with endometrial hyperplasia diagnosed by pathological biopsy were selected， including 31 specimens of simple and complicated endometrial hyperplasia and 30 specimens of atypical endometrial hyperplasia; 30 normal endometrium specimens were selected as controls. The positive expression rates of P37， P16 and PAX-2 protein in different tissue specimens were detected by immunohistochemical SP method. Results There was no positive expression of P37 protein in normal endometrium tissues， the positive expression rate in atypical hyperplasia was higher than simple or complex hyperplasia， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive expression of P16 protein showed atypical dysplasia tissue < simple or complex hyperplasia < normal endometrium tissue， the difference was statistically significant （P < 0.01）， while the positive expression of PAX-2 protein showed atypical dysplasia < simple or complex hyperplasia < normal endometrium tissue， the difference was statistically significant （P < 0.01）. Conclusion There exists abnormal expression of P37， P16 and PAX-2 in atypical endometrial hyperplasia， which is worthy of further study.

[Key words] P37; P16 protein; PAX-2; Endometrial hyperplasia

子宮内膜增生的发生系因长期无孕激素拮抗的雌激素作用所致，是非生理性、非侵袭性的内膜增生现象，因腺体大小、形态、腺体与间质比例的改变而导致子宫内膜量表达增加[1-2];而依据其增生程度不同，又分为增生内膜、简单增生、复杂增生、不典型增生四个等级，其中增生内膜、简单及复杂型内膜增生皆为不伴不典型的子宫内膜增生，预后一般良好;而不典型增生被认为是子宫内膜癌癌前病变，其临床诊治难度大，且预后相对较差[3-4]。

P37蛋白是猪鼻支原体的主要免疫原，既往有报道指出P37蛋白作为原核细胞微生物，其不仅多种疾病密切相关，在肿瘤疾病的发生、侵袭、转移中亦发挥重要价值[5];P16基因则是由INA4a-ARF位点编码的MTS-1基因，系抑癌基因的一种，可直接参与细胞生长增殖及分裂负调控过程，其基因编码产物P16蛋白定位于细胞核蛋白，是细胞周期依赖激酶抑制剂2A，对细胞分裂周期关键酶CDK4的合成、催化活性均有抑制作用，一旦P16蛋白低表达、失表达便可引起细胞周期紊乱、细胞生长失去控制，最终产生恶变，形成肿瘤[6]。而PAX-2则是PAX家族成员之一，通常情况下，是肿瘤细胞生存所必须的条件之一，有研究指出其在子宫内膜癌中有异常表达现象，但关于其具体表达却存异议[7-8]。鉴于此，本研究收集子宫内膜增生标本，对P37、P16、PAX-2蛋白在子宫内膜增生症中的表达及意义进行研究，旨在进一步补充及完善子宫内膜不典型增生的临床诊治，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年12月～2017年8月在河北省秦皇岛市妇幼保健院（以下简称“我院”）接受病理活检并经病理组织学活检确诊为子宫内膜增生患者的病理标本，所有患者既往均无子宫内膜增生相关治疗史。其中单纯型及复杂型子宫内膜增生标本31个（单纯型16个，复杂型15个）、不典型子宫内膜增生组织标本30个;另选取30个正常子宫内膜组织标本作为对照，这些组织标本均来自同期于我院就诊的子宫脱垂、子宫颈癌患者的正常子宫内膜组织。所有病理组织标本固定后均采用梯度酒精（低～高）充分脱水，并用石蜡包埋，按4 μm厚度连续切片，使组织充分紧贴于硅化载玻片，完成脱水、石蜡包埋、制片后封存。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学SP法

SP试剂盒来自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：512821CB。取病理组织标本置于恒温箱烘烤，温度60℃、时长30 min，烘烤后再将标本置于纯二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中浸泡，时长30 min，再采用梯度酒精溶液浸泡，浸泡顺序由高到底，再用PBS液（0.01 mol/L PBS粉+1000 mL蒸馏水，pH值7.2～7.4）充分洗涤，5 min/次，重复PBS洗涤3次;3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶后，按5 min/次PBS液冲洗3次后抗原修复，将柠檬盐酸抗原修复液置于压力锅大火加热煮沸，再放入组织标本后继续加热，直至减压阀喷气，喷气1～2 min后室温下冷却，再次按5 min/次PBS液冲洗3次;抗原修复后分别滴加一抗（鼠抗人P16单克隆抗人来自北京中杉金桥生物技术有限公司生产;抗P37单克隆抗体PD4为本研究组自制，兔抗人PAX-2单克隆抗人来自cell signaling公司）室温孵育60 min，按5 min/次PBS液冲洗3次后二抗孵育，室温下孵育20 min，再次PBS冲洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，室温孵育30 min，PBS冲洗3次后DAB（DAB试剂盒来自福州迈新生物技术开发有限公司生产）底物显色，室温、暗盒下观察显色情况，5～10 min后终止显色反应，再用苏木精染色2～5 min，蒸馏水冲洗后滴加1%盐酸酒精分化，再次蒸馏水冲洗5～10 min后氨水返蓝，常规梯度酒精脱水、纯二甲苯透明、中性质树胶封片后镜检、拍照。

1.2.2 免疫组化染色结果判定

每张切片随机选取5个视野，单个视野计数100个细胞，高倍显微镜（200倍）下观察细胞计数。

1.2.2.1 P37、P16蛋白阳性表达  按染色组织阳性细胞所占细胞的百分比评价阳性表达，依次为阴性（细胞核、细胞浆内均无棕色颗粒、或出现与背景相似的棕黄色颗粒）、弱阳性（细胞核或细胞浆内可见棕黄色颗粒，阳性百分比为5%～30%）、阳性（细胞内有棕黄色颗粒，比例为>30%～60%）、强阳性（细胞内有颜色较深、分布广泛的棕黄色颗粒，比例>60%），阳性、强阳性视为阳性表达，其中PAX-2陽性细胞为棕黄色或棕褐色颗粒。

1.2.2.2 PAX-2蛋白阳性表达  以细胞胞核或细胞胞浆内可见深黄色或棕黄色颗粒为阳性反应，高倍显微镜下随机选取5个视野，其中细胞核内无着色计0分、细胞核内见浅黄色颗粒计1分、细胞核内见棕黄色颗粒计2分、细胞胞核内见棕褐色颗粒计3分;染色细胞比例不足10%计0分、10%～25%计1分、>25%～50%计2分、>50%计3分，以细胞核着色强度、染色细胞比例乘积>3分为PAX-2蛋白阳性表达。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

子宫内膜增生症组织中P37蛋白表达为棕黄色，位于细胞浆内，而P16蛋白在子宫内膜增生症组织中均大量定位于组织细胞胞浆内，经免疫组化染色法可见细胞浆内染色为棕褐色或棕黄色，PAX-2蛋白在子宫内膜间质细胞中位于细胞胞核，以棕褐色着色为阳性表达。

正常子宫内膜组织中未见P37蛋白阳性表达，不典型增生症中阳性表达率高达43.33%，单纯型或复杂型增生症组织中偶见阳性表达，表达率为9.67%，两种子宫内膜增生症患者的子宫内膜组织中P37蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）;正常子宫内膜组织中P16蛋白均呈阳性表达，单纯型或复杂型增生组织中阳性表达率为87.09%，P16蛋白阳性表达情况：不典型增生组织（70.00%）<单纯型或复杂型增生组织<正常子宫内膜组织，差异有高度统计学意义（χ2 =12.262，P < 0.01）;而PAX-2蛋白在不典型增生组织阳性表达为33.33%，单纯型或复杂型增生为67.74%，正常子宫内膜组织则高达96.67%，PAX-2阳性表达情况：不典型增生组织<单纯型或复杂型增组织<正常子宫内膜组织，差异有高度统计学意义（χ2 =26.855，P < 0.01）。见图1～3（封四），表1。

3 讨论

子宫内膜不典型增生是子宫内膜癌癌前病变，子宫切除、子宫切除+双附件切除等外科手术方案虽能取得一定治疗获益，但于有生育要求的子宫内膜增生患者，外科手术切除导致其失去生育功能[9]。随着当今对肿瘤基因、肿瘤分子生物学的研究日渐深入，多种癌基因、抑癌基因在肿瘤疾病的发生、转移、侵袭中发挥的重要作用已引起临床重视，为肿瘤疾病的早期诊断、预后评估及治疗提供了新方向[10]。P37不仅是猪鼻支原体的主要免疫原，也是高亲和力运输系统的一部分，可诱导外周血单核细胞释放肿瘤坏死因子，也可与细胞骨架蛋白NORPEG产生相互作用力，既往有研究表明[11]，经转染P37基因的AGS细胞形态显著变小、变圆，细胞间黏附能力降低，并最终通过对细胞形态、细胞间黏附能力的影响改变细胞影响、运动、黏附能力，与肿瘤细胞转移、生物个体发育有密切关联。本研究显示，正常子宫内膜组织中未见P37蛋白阳性表达，单纯型或复杂型增生症中偶见阳性表达，表达率仅为9.67%，而不典型增生症中阳性表达率高达43.33%;Gomersall等[12]的研究也得出类似结论，认为P37蛋白可激活TLR4受体，诱导癌症进展的基因表达，其研究还指出P37蛋白或可通过对肿瘤相关炎症因子的调控影响肿瘤细胞的生长、侵袭、转移。而子宫内膜不典型增生作为子宫内膜癌癌前病变，P37异常阳性表达或可促进疾病进展至子宫内膜癌。

基于细胞分子生物学角度，细胞恶性肿瘤病变的本质系因细胞周期紊乱导致细胞生长增殖及凋亡失控所致;而P16蛋白是抑癌基因的一种，不仅直接参与细胞生长增殖，也阻止细胞周期从G期进入S期，从而对细胞有丝分裂进行负调控[13]，本研究显示，正常子宫内膜组织中P16皆呈阳性表达，而在单纯型或复杂型增生、不典型增生组织中呈递减表达趋势，提示P16蛋白表达异常，细胞增殖、分裂负调控失控，提示P16蛋白表达缺失或在疾病恶性病变中发挥一定作用，这与陆萍等[14]的报道有类似指出，其研究指出，正常子宫内膜组织、不典型增生、子宫内膜癌中均有阳性表达，且正常子宫内膜组织中P16蛋白阳性表达显著高于子宫内膜癌;但杨小风等[15]却报道，在宫颈组织中，P16蛋白阳性表达却呈现不同趋势，其报道中子宫上皮内瘤变Ⅰ级中P16蛋白阳性表达仅为12.50%，而子宫上皮内瘤变Ⅱ级、Ⅲ级及子宫颈癌却分别高达84.60%、100.00%、100.00%。

同时，既往研究中，PAX-2蛋白在泌尿生殖系统相关疾病的发生、发展中扮演重要角色，多种肿瘤疾病中均有阳性表达[16]，而本研究中不典型增生组织中PAX-2蛋白阳性表达（33.33%）<单纯型或复杂型增生（67.74%）<正常子宫内膜组织（96.67%），差异有高度统计学意义（P < 0.01），提示PAX-2蛋白或可随病变程度的加重出现缺失加剧现象;张彤等[17]在增生期子宫内膜中阳性表达高达95.45%，在单纯型子宫内膜增生、复杂性子宫内膜增生中阳性表达依次为71.42%、70.00%，在非典型性增生中阳性表达却仅为38.70%，这与本研究所得结论趋势一致，但当前关于PAX-2蛋白在子宫内膜增生症中的功能及其相关机制研究仍相对罕见，还需进一步深入探究[18-20]。

综上所述，P37、P16、PAX-2在不同类型的子宫内膜增生症中表达均有一定差异，在子宫内膜癌癌前病变中存在过表达或表达缺失现象，鉴于当前P37、P16蛋白、PAX-2在子宫内膜增生症中的表达及其意义类报道相对少见且研究所得结论的差异性，其具体机制仍需进一步深入探究。

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（收稿日期：2018-08-13  本文编辑：苏   畅）