菌草绿洲一号内生菌的分离鉴定及其生物学特性研究

叶文雨 谢序泽 连加淳

摘 要 菌草（JUNCAO）是用于栽培食用菌、药用菌的草本植物。以菌草绿洲一号为研究材料，通过植物组织表面消毒、研磨组织、培养基培养等方法分离纯化内生菌，并进一步通过分子手段鉴定菌株，通过平板对峙法等方法对其生物学特性进行研究。16S rDNA序列同源性分析结果表明，该菌株为Enterobacter ludwigii；平板对峙等生物学特性试验结果表明，该菌株对马铃薯早疫病菌具有拮抗作用。该菌株具有溶磷性、接触酶反应呈阳性、能使明胶液化、水解淀粉等生物学特性。根据菌株的拮抗特性和其他生物学特性结果可以推测，该菌株可作为生防菌防治植物病原菌及作为促生菌促进植物的生长，提高产量。

关键词 绿洲一号内生菌 ；分子鉴定 ；生物学特性

中图分类号 S54 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.01.011

Abstract JUNCAO are herbaceous plants that can be used as the substrate for edible and medicinal fungi cultivation. In this study， the stem of LVZHOU No. 1 was used as the research material， and the DLJ2 strain were isolated and purified by the surface disinfection of the plant tissue and the culture of the culture medium， and the DLJ2 strain was identified as Enterobacter ludwigii by 16S rDNA sequence. The biological characteristics of the DLJ2 strain were studied. The strain DLJ2 has antifungi activity against Alternaria solani. It was found that the strain fjg112 has phosphorus solubilization， catalase-positive and gelatin liquefaction positive and hydrolyze starch positive. This study provided a new insighe into the development of endophytes resources from JUNCAO.

Keywords endophytic bacteria ； molecular identification ； biological characteristics

內生菌（Endophyte）是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部的微生物，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌[1-4]。发掘植物内生菌资源多样性已成为研究植物与微生物的主攻方向之一。内生菌可以提高植物产量、提高植物的抗逆性、降低化肥使用量、减少水土污染、保持农业可持续发展、改善生态环境。内生菌具有可促进植物生长、抑制植物病害等作用[5-10]。Sessitsch等[11]和黎起秦等[12]从马铃薯组织中获得的内生菌对马铃薯环腐病有抑制作用。杨海莲等[13]从水稻根中分离得到一株阴沟肠杆菌，用该菌发酵液对种子进行浸泡处理或喷雾处理后，该菌对水稻白叶枯病生防效果显著。Kajula等[14]的研究表明，茶叶内生菌可产生铁菌素类物质，对茶树的营养生长具有促进作用。

柑橘根部中的内生细菌类芽孢杆菌（Paenibacillus validus）对叶片中黄龙病病菌的生长有明显的抑制作用[15]。菌草（JUNCAO）是可作为栽培食用菌、药用菌的草本植物。菌草营养丰富、植株高大、单位面积产量高、适应性强、资源丰富、易于人工栽培、资源可持续利用等，隶属被子植物门、单子叶植物纲、禾本科、芦竹属，是栽培香菇、木耳、灵芝等多种食（药）用菌的优质培养基，还是优良的护堤植物，并可用于制造纸等，是荒漠化地区恢复植被的优良草种[16]。 绿洲一号是其中重要菌草之一。植物内生菌已经成为当前微生物学研究的热点之一，是有待深入开发的资源宝库[17-18]。挖掘菌草本身的内生菌潜能是解决农业可持续发展的有效途径。为了探明菌草绿洲一号体内是否存在具有拮抗和促生作用的内生菌，本研究以福建菌草绿洲一号为试验材料，通过植物组织表面消毒和培养基培养法分离筛选和鉴定其体内的内生菌资源并研究其生物学特性，为开发菌草内生菌资源和筛选新型抑菌活性化合物奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料及培养基

绿洲一号菌草样本采自福建农林大学城菌草种植基地，选取无病虫害侵染且生长旺盛的绿洲一号菌草植株。

禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）保存于本实验室、马铃薯早疫病菌（Alternaria solani）由詹家绥博士赠与。

内生细菌分离采用NA培养基：胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，牛肉膏3 g/L，琼脂15 g/L pH 7.20。病原真菌培养用 PDA 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂40.1 g/L。加碘反应和触酶反应用LB 固体培养基：LB 液体培养基加琼脂15 g/L 。

内生细菌的运动作用用LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L 。

无机磷溶解PKO培养基：FeSO4 0.003 g/L，葡萄糖10 g/L，Ca3（PO4）2 5.0 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，MnSO4 0.03 g/L，MgSO4·7H2O 0.03 g/L，NaCl 0.2 g/L，KCl 0.2 g/L，琼脂20 g/L，pH 6.8～7.0。其中，Ca3（PO4）2过筛并单独灭菌后与培养基混合。

淀粉水解用培养基：可溶性淀粉2 g/L，NaCl g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，琼脂18 g/L，配好后调pH至7.0。

明胶液化培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基1 000 mL/L，明胶12 g/L，把它们在水浴锅中熔化混匀，调pH至7.2～7.4，于121℃高压灭菌30 min。

病原菌拮抗试验用PDA 固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂40.1 g/L。

1.1.2 试剂和仪器

蛋白胨，葡萄糖，牛肉膏，琼脂，葡萄糖，（NH4）2SO4，NaCl，KCl，MgSO4·H2O，MnSO4，FeSO4·7H2O，酵母粉，Ca3（PO4）2，马铃薯葡萄糖琼脂，明胶，可溶性淀粉等常规药品均为国产分析纯。2×Taq PCR Master Mix，TPS溶液，液氮，次氯酸，酚氯仿，乙醇，无菌水。恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，分析天平，恒温培养箱，PCR仪，冰箱。

1.2 方法

1.2.1 绿洲一号菌草内生菌的分离纯化

取采集回来的绿洲一号，剪取健康的部位对其进行表面消毒，先用自来水冲洗干净，晾干水分后，转入超净工作台中用70%酒精漂洗5 min，再用2%的次氯酸钠漂洗3 min，最后用无菌水冲洗5～7次，将最后一次洗涤的无菌水涂板到NA培养基上，28℃培养3 d，若对照培养基中无菌落出現表明消毒完全。若消毒不完全，则须重新进行消毒。在无菌条件下，分别切取植株的茎，剪成0.5 cm的小段或小块，将组织块分别放入无菌研钵中，充分研磨成匀浆；取50～100 μL组织研磨汁液接种到NA培养基上进行涂板，每处理重复3次， 置于28℃恒温培养箱中培养2～3 d，观察培养出的菌落形态，然后根据菌落特征的不同，挑取平板中不同形态、颜色的单菌落，进行平板划线分离、纯化，保存备用[19-21]。

1.2.2 内生菌的分子鉴定及同源性比对

DNA的提取根据细菌基因组DNA[22]试剂盒（天根生化科技有限公司）说明进行提取。采用细菌的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）进行16S rDNA扩增。PCR反应体系总体积为25 μL，其中Taq Mix DNA聚合酶12.5 μL，上游引物1 μL， 下游引物1 μL，模板DNA 1 μL，去离子水9.5 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火90 s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物送博尚生物公司进行测序。将测定的序列与Genbank 中已知序列进行Blast同源性比对分析，可初步鉴定其为Enterobacter ludwigii。登陆NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）利用BLAST将测序结果与GenBank中的已知序列进行比对，查找相似性最高的菌株，并根据16S rDNA序列相似性进行分子鉴定，用MEGA 5.2软件构建出系统发育树[23-24]。

1.2.3 淀粉水解反应

在淀粉培养基基上接种内生菌，一皿不接种做空白对照，置28℃恒温培养箱培养2～3 d后，在平板上滴加碘液，观察其菌落处，若菌落处呈透亮的菌落色泽则记为淀粉试验阳性（+），若菌落处呈蓝黑色记为淀粉试验阴性（-）[25]。

1.2.4 触酶反应

用灭菌枪头挑取少许内生菌于干净的载玻片上，用移液枪滴10 μL过氧化氢溶液于菌落上，观察反应，并拍照记录[25]。

1.2.5 溶磷作用

在溶磷培养基上接种内生菌，置于28℃恒温培养箱中培养10 d，11 d后测量内生菌菌落直径（d）和溶磷透明圈直径（D），并计算D/d数值，有透明圈的菌株即代表具有溶磷能力[26]。

1.2.6 拮抗作用

采用平板对峙法，在PDA平板中央接种内生菌，在距内生菌左右2.0 cm处 接种供试病原真菌，以不接种内生菌作为对照，每个处理3个重复，置于28℃培养箱中培养5～7 d[27]。

2 结果与分析

2.1 内生菌的分离纯化

利用组织表面消毒和培养基培养法对菌草绿洲一号茎（图1）的内生菌进行分离并纯化，共得到内生菌株4株，经过鉴定，其中一株内生菌DLJ2对病原菌抑菌效果明显，因此选择DLJ2做后续试验。

2.2 菌株的分子鉴定及同源性比对

以分离自绿洲一号的菌株DLJ2的基因组DNA为模板，用 16S rDNA基因通用引物27F和1492R进行PCR扩增，PCR产物用1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增产物送博尚生物科技有限公司测序。将所获得序列用BLAST软件与GenBank中已报道的菌株16S rDNA序列进行比对，用Mega 5.2软件构建系统进化树（Bootstrap=1 000），结果显示，内生菌DLJ2与Enterobacter ludwigii亲缘关系最近，确定其为肠杆菌属内生菌（Enterobacter ludwigii）（图2），命名为Enterobacter ludwigii DLJ2。

2.3 淀粉水解

某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。结果表明，DLJ2菌株可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色（图3）。

2.4 触酶试验

触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。试验结果表明，菌株DLJ2有产生过氧化物酶，当加入过氧化物时，菌株中形成氧分子，由此而产生气泡（图4）。

2.5 溶磷作用

采用溶磷圈法对细菌的溶磷特性进行测定。用枪头将供试菌株分别点接种于溶磷培养基上，置于 30℃ 培养箱中培养4 d，观察到有透明溶磷圈产生（图5），其所产生的解磷圈外径与菌落生长的直径比值（D/d）为1.353，具有一定的溶磷作用。

2.6 抑菌作用

以马铃薯早疫病菌和小麦赤霉病菌2种植物病原真菌作为指示菌，对分离到的DLJ2内生菌进行抑菌活性篩选，用平板对峙的方法测定菌株DLJ2的拮抗效果，试验结果见图2。DLJ2对马铃薯早疫病菌具有较强的抑制活性，显示出明显的抑菌带（图5） 。

2.7 明胶液化试验

某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体。试验结果表明，菌株DLJ2具有胶原酶，使明胶分解，失去凝固能力，呈现液体状态，可用于肠杆菌科的鉴别（图6）。

3 讨论与结论

3.1 讨论

本研究从菌草绿洲一号健康植株的茎中分离筛选获得一株对马铃薯早疫病菌有显著拮抗作用，且具溶磷作用、接触酶反应呈阳性、能使明胶液化、水解淀粉等生物学特性的内生细菌菌株。基于该菌株的形态、生理生化及分子生物学特征，将其鉴定为路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii），命名为Enterobacter ludwigii DLJ2。DLJ2 菌株对2种常见植物病原菌具有不同程度的抑制作用。 王舒等[28]于2016年从油茶根际分离出了路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii），该菌株具有溶磷作用。现有的研究表明，路德维希肠杆菌可产生产1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）、IAA、抑菌活性物质，并有促进宿主植物生长等功能[29]。本研究结果表明，路德维希肠杆菌作为内生菌存在于健康菌草绿洲一号组织中，理论上不仅可以促进植物的生长，且可产生对马铃薯早疫病菌有抑菌作用的物质，增强对马铃薯早疫病害的抵抗能力。马铃薯早疫病是马铃薯主产区重要病害之一，普遍大面积连片发生，病株率达到80%以上，很多田块达到100%，造成严重损失。马铃薯早疫病已经成为威胁马铃薯生产的重大障碍。本研究结果初步表明，从菌草绿洲一号中分离的内生拮抗和促生细菌路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii） 菌株具有进一步开发为作物病菌生防菌的潜力。后续研究将分离纯化 Enterobacter ludwigii DLJ2菌株的主要抑菌活性成分，深入研究其对马铃薯早疫病和其他病原真菌的拮抗作用机制以及对植物的促生作用机制等。此外，该菌株的使用是否存在生物残留，是否会影响马铃薯的食用品质等问题也尚待进一步研究。溶磷菌具提高土壤磷素的利用效率和促进作物苗期生长的作用，菌株DLJ2作为拮抗菌株和溶磷菌株，有待通过大田试验以确定DLJ2菌株的大田应用效果，田间防效试验也需要进一步的研究。由于田间试验常受天气等因素影响，故后续将连续几年进行田间重复试验，探究Enterobacter ludwigii DLJ2菌株对马铃薯早疫病的田间防效及促进植物生长的作用，以期为该菌株在生产中应用于防治马铃薯早疫病和促进植物生长提供更为可靠的技术支持。另外，该菌株是否还对其他病原菌具有拮抗作用和对哪种植物具有明显的促生作用，以及在大田条件下的抗病原菌及促进植物生长情况等等均有待进一步探究。

3.2 结论

本研究从福建农林大学菌草基地选取生长良好的菌草绿洲一号，从其茎中分离得到一株具有拮抗和溶磷作用的菌株DLJ2，该菌株还具有接触酶反应呈阳性、能使明胶液化、水解淀粉等生物学特性，从生理生化特性和16S rDNA扩增鉴定其为肠杆菌属（Enterobacter ludwigii），该菌具有作为生防菌及促生菌应用于植物病原菌防治、促进植物生长及植被恢复等方面潜力。

参考文献

[1] Stone J K， Bacon C E， White J F Jr. An overview of endophytic microbes： endophytism defined microbial endophytes[M]. New York： Marcel Dekker， 2000： 3-29.

[2] Ambrose C，Varghesec C，Subhash J B，et al. Endophytic bacteria as a source of novel antibiotics：An overview[J]. Pharma-cognosy Rev， 2013， 7（13）： 11-16.

[3] Singh R， Dubey A.Endophytie actinomyeetes as emerging source for therapeutic compounds[J].Indo Global Journal of Pharmaceutical Sciences，2015，5（2）：106-116.

[4] Pimentel M R，Molina G，Dionisio A P，et al. The use of endophytes to obtain bioacfive compounds and their ap-plication in biotransformation process[J].Bioteclmol Res Int，2011，2011（5）：576-286.

[5] Puri A， Padda K P， Chanway C P. Evidence of nitrogen fixation and growth promotion in canola （Brassica napus L.） by an endophytic diazotrophPaenibacillus polymyxaP2b-2R[J]. Biology and Fertility of Soils， 2016， 52（1）： 119-125.

[6] Yaish M W， Antony I， Glick B R. Isolation and charac-terization of endophytic plant growth-promoting bacteria from date palm tree （Phoenix dactylifera L.） and their potential role in salinity tolerance[J]. Antonie Van Leeu-wenhoek， 2015， 107（6）： 1 519-1 532.

[7] Mehta P， Walia A， Kulshrestha S， et al. Efficiency of plant growth- promoting P-solubilizing Bacillus circulans CB7 for enhancement of tomato growth under net house conditions[J]. Journal of Basic Microbiology， 2015， 55（1）： 33-44.

[8] Wei C Y，Lin L， Luo L J， et al. Endophytic nitrogen-fixing Klebsiella variicola strain DX120E promotes sugarcane growth[J]. Biology and Fertility of Soils， 2014， 50（4）： 657-666.

[9] Ji S H， Gururani M A， Chun S C. Isolation and character-ization of plant growth promoting endophytic diazotrophic bacteria from Korean rice cultivars[J]. Microbiological Research， 2014， 169（1）： 83-98.

[10] Tariq M ， Hameed S ， Yasmeen T ， et al. Molecular characterization and identification of plant growth promoting endophytic bacteria isolated from the root nodules of pea （Pisum sativum L.）[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology， 2014， 30（2）： 719.

[11] Sessitsch A，Puschenreiter M.Endophytes and rhizosphere bacteria of plants growing in heavy met-al-containing soils. 2008： 317-332.

[12] 黎起秦，罗 宽，林 纬，等.内生菌b47的定殖能力及其对番茄青枯病的防治作用[J].植物保护学报，2006，33（4）：363-368.

[13] 杨海莲，孙晓璐，宋 未，等.水稻内生阴沟肠杆菌mrl2的鉴定及其固氮和防病作用研究[J].植物病理学报，2001，31（1）：92-93.

[14] Kajula M， Tejesvi M V， Kolehmainen S， et al. The siderophore ferricrocin produced by specific foliar endophytic fungi in vitro[J]. Fungal Biology， 2010， 114（2/3）： 248-254.

[15] Trivedi P，Spann T，Wang N. Isolation and charac-terization of beneficial bacteria associated with citrus roots in Florida[J].Microbial Ecology，2011，62（2）： 324-336.

[16] 林占熺. 菌草學[M]. 北京：国家行政学院出版社，2013.

[17] Hardoim P R， van Overbeek L S， Berg G， et al. The hid-den world within plants： ecological and evolutionary considerations for defining functioning of microbial endophytes[J]. Microbiology and Molecular Biology Re-views， 2015， 79（3）： 293-320.

[18] Qin S， Xing K， Jiang J H， et al. Biodiversity， bioactive natural products and biotechnological potential of plantassociated endophytic actinobacteria[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2011， 89（3）： 457-473.

[19] 李乐溪，嵇静静，周亮吟，等. 大蒜产香内生真菌的分离及挥发性成分分析[J]. 生物资源，2017，1（39）：70-73.

[20] 韦智钟，刘梦雅，李 真，等. 大蒜内生菌的分离及其抑菌作用的研究[J]. 黑龙江农业科学，2013（12）：5-9.

[21] 何 红，蔡学清，洪永聪，等. 辣椒内生细菌的分离及拮抗菌的筛选[J]. 中国生物防治，2002，18（4）：171-178.

[22] 邹家兴，李国基，耿予欢. 腐乳发酵过程中细菌种群变化的鉴定与分析[J]. 现代食品科技，2008，24（5）：424-438.

[23] Julie D Thompson， Toby J Gibson， Frederic Plewniak， et al. The CLUSTAL X windows interface： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools [J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（24）： 4 876-4 882.

[24] Li X X，Zhang M L，Fu Y Y，et al. Analysis of rhizobia isolated from melilotus by 16S rDNA-RF LP[J]. Acta Bot Boreal（Occident Sin），2008，28（3）：1 569-1 573.

[25] 赵 斌，何绍江. 微生物学实验[M]. 北京：科学技术出版社，2002.

[26] 张国壮，李海超，孙永林，等. 5株产ACC脱氨酶细菌的筛选与鉴定[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版） ，2014，42（6）：189-196.

[27] 欧雄常，柳 凤，何 红，等. 红树内生细菌AmS2对多种植物病原真菌的抑制作用[J]. 广东农业科学，2013，40（5）：73-75.

[28] 王 舒，张林平，张 扬，等. 红壤区油茶根际解磷细菌的筛选、鉴定及其解磷能力[J]. 林业科学研究，2016，3：409-416.

[29] 黄 盖，高 焓，王 琛，等. ACC脱氨酶活性菌株 ACC30的分离、鉴定及其促生作用[J]. 微生物学通报， 2013，40（5）：812-821.