养血补肾方对实验性近视眼视网膜p-Stat3活性蛋白的表达影响

邢凯 ，亢泽峰 ，吴宁玲 ，刘健 ，刘彦江

养血补肾方是庄曾渊研究员治疗高度近视的经验方，前期动物实验结果显示该方可以降低豚鼠形觉剥夺性近视（form-deprivation myopia,FDM）模型眼的巩膜细胞凋亡率，抑制巩膜的重塑变薄和异常拉伸[1]，但对其上游机制尚不清楚，比如对信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）途径是否存在影响。SATA3是Janus激酶/信号转导与转录激活因子 （Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT）家族成员，晶状体、视网膜、脉络膜组织中均有这一家族成员的分布[2-4]，JAK/STAT通路是近年来新发现的一条信号转导途径，有研究提示STAT3信号通路与FDM的发生有关[5]。本实验在建立豚鼠FDM模型的基础上应用免疫组织化学方法研究磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白在实验性近视眼中的动态表达，为进一步探讨养血补肾方对这一通路在近视形成与发展中所起的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：取2周年龄大小的普通级三色健康豚鼠，40只，雄性，由北京科宇动物养殖中心提供，体质量180～200 g，动物许可证号为SCXK （京）2012-0004。动物房温度控制在20～22℃之间，正常饲养，添加5 mg/L维生素C。

养血补肾方：车前子15 g，枸杞子15 g、熟地黄15 g、覆盆子 15 g、五味子 15 g、丹参 12 g、当归 12 g、菟丝子 15g、白芍 12g、川芎 12g、黄芪 20g、白术 12g，采购于北京燕北饮片厂。

主要实验仪器：YZ24带状光检影镜 （南昌高腾科技有限公司），眼科A/B型超声诊断仪（徐州市凯信电子设备有限公司），B×51显微镜，ASP 300S自动脱水机 （德国徕卡公司），LEICA 255铺片机，BM 450A型多功能包埋机，德国徕卡公司EMTP全自动组织处理机，JEM-1400电镜 （日本电子），RM2255切片机（德国Leica公司），EG1150C冰台（德国Leica公司），HI1220 烤片机（德国 Leica公司），EI1210摊片机（德国Leica公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 豚鼠实验性近视制备与分组 制备豚鼠FDM模型[6]：取40只2周龄普通级三色健康豚鼠，雄性，标记。饲养1周后予检影、验光、测量眼轴长度（方法见下），以右眼作为FDM模型眼（遮盖眼），半透明塑料（即白色气球制作）眼罩遮盖，左眼作为对照眼（未遮盖眼）不做处理。

正常喂养60 d后，再次进行检影、验光检查并测量眼轴，确定成功建立FDM模型[6]。将豚鼠随机分成2组，各组均为20只，对照组不行任何处理，治疗组以养血补肾方12.7 g/kg灌胃（按照生药量），给药21 d后进行取材检测。

1.2.2 检测眼屈光度数 在暗室条件下应用1%复方托吡卡胺滴眼液（美多丽）给豚鼠散瞳，检影验光。FDM模型建立前后均要检查双眼1次。

1.2.3 测量眼轴长度 在室内自然光条件，豚鼠结膜囊滴0.4%盐酸奥布卡因滴眼液（倍诺喜）表麻，应用眼科A/B超测豚鼠双眼的眼轴长度，测量3次，最后取平均值，记录。FDM模型建立前后均要检查双眼1次。

1.2.4 视网膜组织显微镜观察 在实验结束以后，采用 1 g/L 氯胺酮来麻醉豚鼠（75～100 mg/kg）,然后剪开眼球结膜,并立即摘除豚鼠的双侧眼球,再在显微镜下沿眼球角巩膜缘逐步剪开,剥离豚鼠眼球的巩膜和视网膜,并将巩膜和视网膜组织置于4%多聚甲醛固定液中，固定。在24 h以后取出视网膜组织，脱水透明浸腊以后，包埋切片，脱水，染色，封片。

1.2.5 免疫组织化学染色法检测 取实验中豚鼠对照组及其治疗组豚鼠各8只，处死摘除眼球，常规石蜡包埋，取视网膜组织以备同时采用了Western blot法提取蛋白，所有组织蜡块于近后极部连续切片7张，每张切片厚5 μm，用于免疫组化染色。免疫组织化学染色切片采用“北航图像分析系统”测量阳性区灰度值，作为p-STAT3在组织中的半定量表达，随机分别选取后部视网膜各10个部位进行图像扫描，用平均灰度值表示p-STAT3的相对蛋白表达量。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，豚鼠双眼屈光度、眼轴长度比较以及同一眼造模前后的屈光度、眼轴长度比较均采用配对资料t检验，同期组间比较采用两独立样本t检验；对免疫组织化学法检测p-Stat3，采用单因素方差分析，各组数据用均数±标准差(x¯±s)表示，若 P＜0.05，则认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 屈光度改变

造模前幼年豚鼠拟造模眼与对照眼的屈光度分别为（3.924±3.392）D，（3.860±1.597）D，均呈远视状态，差异无统计学意义（P=0.089）。模型眼遮盖60 d后，屈光度变化为（-2.583±2.954）D，同期对照眼的屈光度为（3.488±1.281）D。模型眼形成了（-6.507±1.738）D的相对近视，与同期对照眼及造模前自身比较，差异均有统计学意义（与同期对照眼比较P=0.001；与造模前自身比较，t=14.116，P=0.001），对照眼屈光度前后变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。 （表 1）

2.2 眼轴长度对比

造模前幼年豚鼠拟造模眼与对照眼的眼轴分别为（7.557±0.176）mm，（7.612±0.218）mm，差异无统计学意义（P=0.084）。完成造模后，豚鼠模型眼、对照眼的眼轴分别变为（8.278±0.250）mm，（8.016±0.199）mm，较前均有增加（模型眼，t=-15.379，P＜0.01；对照眼，t=-7.505，P＜0.01），模型眼的眼轴大于同期对照眼，有统计学意义（P＜0.01）。 （表 1）

2.3 视网膜组织病理学改变

HE染色显示：对照组模型眼视网膜外丛状层会有空泡状结构出现，外核层细胞层数减少，可见部分细胞核溶解，内核层细胞数目减少，有空泡状结构存在，也可见到细胞核溶解或者碎裂，外丛状层变薄，有空泡及毛刷状结构出现，神经节细胞层间隙增大，可见细胞水肿。治疗组模型眼视网膜可见少量外节状层会有泡状结构出现，部分细胞水肿（图1）。

表1 豚鼠屈光度和眼轴变化（x¯±s）

2.4 视网膜中p-STAT3的表达

p-STAT3阳性细胞的细胞核呈棕黄色，对照组对照眼的p-STAT3阳性细胞主要分布在视网膜神经节细胞层及内核层，外核层偶见（图2A)；对照组模型眼视网膜组织的p-STAT3有微弱表达（图2B)，主要分布在视网膜色素上皮及视网膜光感受器外节的细胞核内；治疗组模型眼阳性细胞位于神经节细胞核，内核层细胞核中，阳性信号为棕黄色颗粒样（图 2C）。

对照组对照眼、对照组模型眼、治疗组模型眼视网膜p-STAT3蛋白表达的平均灰度值分别为0.310±0.055，0.370±0.069，0.365±0.046，三组数值总体上无统计学意义上的差异 （单因素方差分析，F=2.691，P=0.091）。两两比较，对照组模型眼及治疗组模型眼的视网膜p-STAT3蛋白表达均高于对照组对照眼，对照组对照眼与对照组模型眼的差异最大（P=0.049），对照组对照眼与治疗组模型眼（P=0.069），对照组模型眼与治疗组模型眼 （P=0.863）的p-STAT3表达差异均无统计学意义。提示养血补肾方对豚鼠FDM模型眼的视网膜p-STAT3蛋白表达变化无明显影响。

图1 2组豚鼠后极部视网膜组织的光镜图（HE染色，×40）。1A 对照组的对照眼（未遮盖眼），视网膜结构大致正常；1B治疗组的FDM模型眼（遮盖眼），视网膜可见少量外节状层会有泡状结构出现，部分细胞水肿；1C对照组的FDM模型眼（遮盖眼），视网膜外丛状层会有空泡状结构出现，外核层细胞层数减少，可见部分细胞核溶解，内核层细胞数目减少，有空泡状结构存在，也可见到细胞核溶解或者碎裂，外丛状层变薄，有空泡及毛刷状结构出现，神经节细胞层间隙增大，可见细胞水肿。FDM：形觉剥夺性近视

3 讨论

图2 视网膜p-STAT3蛋白表达的免疫组化图（×40）。2A对照组对照眼的p-STAT3阳性细胞主要分布在视网膜神经节细胞层及内核层，外核层偶见；2B对照组FDM模型眼，视网膜组织的p-STAT3有微弱表达，主要分布在视网膜色素上皮及视网膜光感受器外节的细胞核内；2C治疗组FDM模型眼，阳性细胞位于神经节细胞核，内核层细胞核中，阳性信号为棕黄色颗粒样。p-STAT3：磷酸化信号转导和转录激活因子3；FDM：形觉剥夺性近视

已有的研究证实，近视眼的发病与多种因素相关，其中最主要的是遗传和环境因素。最近几年研究发现，Jak-Stat通路可参与一些细胞的增殖、分化和抗凋亡等[7-8]。朱子诚等[5]研究表明STAT3信号通路可能参与了FDM形成与发展，STAT3作为信使，以视网膜光感受器为载体，导致近视的发展[9-10]。

养血补肾方是四物五子汤添加丹参，黄芪，白术共同组成。方中熟地黄、当归、白芍、川芎等中药主要滋阴养血，菟丝子、车前子、枸杞子、覆盆子等药物补肝肾明目，黄芪和白术健脾益气，诸药合用共奏补益肝肾，滋阴补血，养心明目之功效。现代药理学研究[11]四物五子汤中锌含量高，可能是通过补充微量元素锌，改善了眼部的微循环，从而使目系得养，目窍功能恢复正常，该方可以改善眼内微循环,增加眼肌营养,解除睫状肌痉挛,调节屈光度。临床应用中发现该方能改善实验性近视患者的视功能，从一定程度上延缓实验性近视的发展，侯静梅等[1]研究已证实养血补肾方能够明显改善豚鼠形觉剥夺性近视眼巩膜组织的形态，显著降低巩膜细胞的凋亡，其药理机制可能是能够减少巩膜细胞凋亡，从而有效抑制巩膜细胞的重塑变薄和异常拉伸,达到阻止眼轴的变长,控制实验性近视发展的作用。提示养血补肾方可能通过降低巩膜细胞凋亡来发挥对巩膜细胞保护作用。而本实验在建立豚鼠FDM模型的基础上应用免疫组织化学方法研究磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白在实验性近视眼中的动态表达，结果提示：对照组模型眼及治疗组模型眼的视网膜p-STAT3蛋白表达均高于对照组对照眼，对照组对照眼与对照组模型眼比较有统计学差异，对照组对照眼与治疗组模型眼，对照组模型眼与治疗组模型眼的p-STAT3表达差异均无统计学意义，p-STAT3在未遮盖豚鼠眼视网膜中有微弱表达，遮盖后p-STAT3表达相比遮盖前上调，但结果比较无统计学意义，提示养血补肾方对视网膜p-Stat3蛋白的表达变化无影响。

Peterson等[12]研究了一系列应激反应、条件性刺激对CNTF介导的Jak-stat信号通路的影响，结果发现暴露于亚毒性光、机械创伤及全身应用肾上腺素能受体α2激动剂甲苯噻嗪后视网膜中的STAT3被激活。朱子诚等[5]研究发现p-STAT3在形觉剥夺近视发生发展中有重要作用。另外，在生理状态下，生长因子诱导的Stat信号通路激活处在严格的调控之下，但是慢性的或持续的激活可能会扰乱生长因子—STAT3信号通路的内环境稳定，最终导致靶组织的病理改变[13]。但研究发现[14]，几乎所有此类物质(称为一级信使)的受体，均可在色素上皮或黑色素细胞上找到，通过STAT3信号转导通路从而发挥其转录调控作用，调节其下游的某些特定靶基因的表达，如血管内皮生长因子(VEGF)、血管活性肠肽(VIP)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)等[15-16]作用于巩膜，促进后部巩膜的延长产生近视眼，此研究表明p-STAT3在未遮盖豚鼠眼视网膜中有微弱表达，遮盖后p-STAT3表达相比遮盖前上调，说明STAT3信号通路可能参与了FDM形成与发展，p-STAT3作为信使，以豚鼠视网膜光感受器为载体，形成近视并进一步发展，但本研究表明养血补肾方对豚鼠视网膜p-STAT3蛋白的表达变化无影响，故养血补肾方受“肝主筋”、“肝受血而能视”理论启发，是以养血补肾方滋补肝之气血，从而使目之筋膜得到滋养，延缓高度近视巩膜的重塑变薄，从而延缓高度近视的发展。