苦黄栓的制备与刺激性评价

韩润萍，刘志东，皮佳鑫，王舒雅，刘博缨，常梦春

（1.天津中医药大学天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培训基地，天津 301617；2.天津中医药大学现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津 301617）

阴道炎是一种很常见的妇科疾病，分为霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、细菌性阴道炎（非特异性阴道炎），常见症状为白带增多，阴道灼热瘙痒等，严重影响着女性的身心健康[1]。如果不能及时治疗，会导致以下危害：影响夫妻生活，造成不孕，诱发宫颈糜烂，甚至引起宫颈癌恶疾，影响胎儿发育等[2]。从中医角度看，阴道炎的发病机制在于肝肾阴虚，肝郁气滞，湿热下注[3]。除此之外，不良习惯或过度清洁，免疫力低下和绝经后内分泌失调等因素也可引发阴道炎。中医治疗阴道炎以驱除湿热之邪为主[4]。苦黄栓处方由苦参，儿茶，黄柏，紫草及冰片组成。苦参有抑菌作用，可杀死阴道滴虫，对湿热下注及带下色黄效果明显；儿茶有活血散瘀、生肌止血、收湿的功效；黄柏有清热燥湿、泻火解毒及抑菌的功效；紫草有抑菌消炎、活血解毒的作用；冰片有清热止痛、消肿解毒的作用。本课题组拟制备中药妇科栓剂苦黄栓，并考察其阴道给药的安全性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 初成年SD大鼠，雌性，体质量（180～200）g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号SCXK（京）2009-0004。

1.2 仪器 JA2103N千分之一电子天平（上海民桥），加热磁力搅拌（德国IKA集团），RBY-4融变时限检查仪（天津药典标准仪器厂），美国Millipore去离子水机。

1.3 药品与试剂 聚氧乙烯（40）单硬脂酸酯（南京威尔化工有限公司），聚乙二醇1500（南京威尔化工有限公司），聚乙二醇1000（南京威尔化工有限公司），SUPPOCIRENAS50（上海嘉法狮贸易有限公司提供），SUPPOCIRE BS2X（上海嘉法狮贸易有限公司提供）；混合药粉（药厂提供），冰片（药厂提供），乙酸乙酯（分析纯），儿茶素标准品（中国食品药品检定研究院，其量以97.2%计，批号110877-201203），儿茶对照药材（中国药品生物制品检定研究院，批号121397-200401），甲醇（天津市康科德科技有限公司，色谱纯），三氯甲烷（天津市江天化工技术有限公司，分析纯），甲酸（天津市化学制剂批发公司，分析纯），去离子水，生理盐水（中国大冢制药有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 苦黄栓的制备工艺 加热基质（80℃）至完全融化，于50℃，以600 r/min的转速搅拌约5 min；加入已混匀的药粉，于50℃，以600 r/min的转速搅拌5 min至均匀；再加入研细且过80目筛的冰片粉，于50℃，常压条件下，以600 r/min的转速搅拌5 min至均匀；注模，室温冷却。

1.4.2 苦黄栓的基质筛选 考察的油溶性基质有SUPPOCIRE NAS50、SUPPOCIRE BS2X。考察的水溶性基质有聚氧乙烯（40）单硬脂酸酯（S40）、聚乙二醇1500（PEG 1500）及聚乙二醇1000（PEG 1000）。分别采用油溶性基质与水溶性基质制备苦黄栓，以制备外观光滑完整，色泽均匀，硬度适宜，融变时限符合中国药典规定的苦黄栓。

栓剂的硬度评分等级：--（软）；-（较软）；0（适中）；+（较硬）；++（硬）。

1.4.3 儿茶的薄层色谱鉴别 取苦黄栓2粒，置具塞锥形瓶内，在90℃水浴中加热融化，取出，趁热加入乙酸乙酯100 mL，充分振摇，放冷，置4℃的冰箱内20 min，取出，滤过，于5 mL滤液内加入2 mL去离子水，上层液作为供试品溶液。称取儿茶素标准品，加入甲醇，制成每1 mL含有2 mg的溶液，作为标准品溶液。称取儿茶对照药材0.2 g，加甲醇10 mL，浸渍20 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。吸取上述供试品溶液、标准品溶液及对照药材溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（20∶5∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰[5]。

1.4.4 SUPPOCIRE NAS50基质苦黄栓的大鼠阴道黏膜刺激性研究 健康的SD雌性大鼠40只，按随机数字表法随机分为4组，每组10只，分别为空白组（不给药）、低剂量组[30 mg/（只·次）]、中剂量组[60 mg/（只·次）]及高剂量组[120 mg/（只·次）]，连续给药7 d，每日2次。每日观察并记录大鼠状态、阴道及外阴是否有充血、红斑或水肿和分泌物等情况，第8天处死，分离阴道组织，肉眼观察阴道黏膜是否有红肿、破溃、出血及分泌物等情况，10%甲醛溶液固定阴道样本，脱水、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，显微镜下进行病理学检查及分析[8-10]。

1.4.4.1 病理切片评价标准 根据黏膜层鳞状上皮、角化层的完整性，基底细胞的状态及炎症细胞的浸润情况进行评价。

0级：低倍镜下黏膜层鳞状上皮及角化层完整清晰，基底细胞未见增生；高倍镜下黏膜层未见或偶见1～2个炎症细胞，黏膜下见少量炎症细胞浸润。

1级：低倍镜下黏膜层鳞状上皮及角化层基本完整，＜1/3区域角化层变薄或基底细胞呈增生状态；高倍镜下黏膜层可见3～8个炎症细胞，黏膜下见少量炎症细胞浸润。

2级：低倍镜下黏膜层鳞状上皮及角化层连续性较好，＞1/3区域角化层变薄、缺失或基底细胞呈增生状态；高倍镜黏膜层可见较多（8～20个）炎症细胞或黏膜层变薄，黏膜下见较多炎症细胞浸润。

3级：低倍镜下黏膜层鳞状上皮及角化层连续性较差，＜1/3区域角化层缺失及表皮脱落坏死；高倍镜下黏膜层可见大量（＞20个）炎症细胞浸润，黏膜上皮细胞坏死脱落，黏膜下见大量炎症细胞浸润。

4级：低倍镜下黏膜层鳞状上皮及角化层连续性差，＞1/3区域角化层缺失及表皮脱落坏死；高倍镜下黏膜层见大量（＞20个）炎症细胞浸润，黏膜上皮细胞坏死脱落，黏膜下见大量炎症细胞浸润。

1.4.4.2 统计方法 采用SPSS17.0统计软件，Kruskal-Wallis H秩和检验进行统计分析。

2 结果

2.1 基质的筛选 分别选择SUPPOCIRE NAS50、SUPPOCIREBS2X及聚氧乙烯（40）单硬脂酸酯（S40）、聚乙二醇1 500、聚乙二醇1 000为基质时，所制栓剂的评价结果见表1。

由表1可知，选用SUPPOCIRE为苦黄栓的基质时，栓剂偏硬，融变时限符合药典规定。当选用聚氧乙烯（40）单硬脂酸酯（S40）为基质时，栓剂较软，融变时限偏长；选用PEG 1500为基质时，栓剂硬度适中，融变时限偏长；选用PEG 1000为基质时，栓剂软，融变时限短。综合考虑，采用SUPPOCIRENAS50作为苦黄栓的基质。

2.2 儿茶的薄层色谱鉴别 为初步建立苦黄栓的质量标准，进行了儿茶的薄层色谱鉴别。在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，供试品色谱显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。见图1。

2.3 大鼠阴道黏膜刺激性实验

2.3.1 解剖前后直观结果 连续给药3 d后，每天第2次给药时，可发现高剂量组部分大鼠有少量药栓残留；连续给药7 d期间，除上述情况外，未见充血、红斑或水肿现象。

表1 苦黄栓的评价结果

第8天解剖取材，可见，高剂量组大鼠出现微量药物残留3例，腔道发干2例；中剂量组出现腔道发干1例；未见红肿、破溃、出血现象。

2.3.2 病理切片分析

2.3.2.1 显微镜下分析 空白组：黏膜层细胞结构清晰完整，未见明显炎症细胞浸润。低剂量组：黏膜层细胞形态结构正常，未见明显异常。中剂量组：黏膜层结构完整清晰，细胞形态结构正常，未见明显炎症细胞浸润。高剂量组：黏膜层结构较完整，但局部散在点状上皮细胞脱落。见图2。

图2 大鼠阴道病理切片显微镜（HE，×400）

2.3.2.2 病理切片评级 按“1.4.3.1”项下的方法进行评级分析，结果见表2。

2.3.2.3 统计学分析 4组大鼠阴道病理切片评级结果差异性比较，采用非参数检验，得到χ2=0.337，P>0.05，无统计学差异。

表2 各组大鼠阴道病理切片评级结果

统计学分析中，各组两两比较的P值见表3。P值均大于0.05，表示各组间无统计学差异。

表3 各组两两比较的P值

3 讨论

阴道给药有见效快、疗效好、生物利用度高和不良作用少的优点[9]，是一种非创伤治疗方式。临床上多采用西药栓剂为阴道炎患者治疗，虽可以得到良好效果，但很难从根本上治愈病症[10]。长期使用的患者容易对药物产生耐药性或依赖性[11]，使得病情反复发作，且可引发严重的阴道炎并发症，重者导致阴道内菌群失衡，较大影响女性患者的生活质量和身体健康[12]。纯中药制剂苦黄栓具有清热解毒，燥湿杀虫及生肌之功效，其作用温和，直接作用于病患处，针对性强，对机体内环境干扰少，可用于阴道炎的治疗。

基质赋予栓剂外形，对制剂中药物的释放和吸收有一定的影响[13]。马慧平等[14]研究了3种不同基质苯巴比妥栓剂的药物动力学，结果有显著性差异。笔者采用SUPPOCIRENAS50作为基质以制备苦黄栓，将进一步研究其动物体内的药物动力学。

除药效之外，阴道给药药物的刺激性试验受到了越来越多的重视[15-16]。本实验中，各给药组大鼠阴道均无红肿，破溃及出血现象；解剖后，高剂量组大鼠有微量药物残留现象，无其他异常；低倍及高倍镜下观察病理切片，各组大鼠阴道黏膜层结构完整清晰，细胞形态正常，未见明显炎症细胞浸润，统计学分析表明，给药组与空白组之间无显著差异。以上可得，苦黄栓为纯中药制剂，对大鼠阴道黏膜无明显刺激性，安全性较好，其临床药效待进一步研究。