乳酸菌对低温下玉米秸秆黄贮发酵品质及有氧稳定性的影响

谢华德，李苗苗， 靳思玉， 王立超， 曹 阳

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

玉米秸秆是子实收获后留下的含纤维成分高、质地比较粗硬的农作物副产物。对玉米秸秆进行青贮、黄贮、微贮等发酵处理可以软化秸秆，提高其营养价值、改善适口性、并提高饲料转化率，是一种有效开发利用秸秆资源的方式（刘海燕等，2016；孙文等，2010；刁其玉等，2005）。发酵饲料的质量通常会受到原料种类、原料品质、贮藏温度、附生乳酸菌等因素的影响（Liu等，2011；Kim等，2006；Lin 等，1992；McDonald 等，1966）。其中，乳酸菌在制作发酵饲料时起着关键的作用（Hu等，2009；赵政等，2009）。在厌氧发酵的环境中，乳酸菌大量繁殖，从而将饲料中的淀粉和可溶性糖变成乳酸，降低pH，抑制丁酸菌、大肠杆菌及霉菌等有害细菌的生长，从而提高发酵饲料质量（Cao等，2011；赵辉等，2010；Cai等，1999）。 然而，当玉米收割期到来时，我国北方的气温下降，尤其东北地区急剧下降，平均气温达到4°C左右（郭志梅等，2005）；在低温条件下发酵的饲料，乳酸菌的活性受到抑制，乳酸发酵很难充分进行，难以达到调制高质量发酵饲料的目的 （Liu等，2012；Cao等2011）。另外，当开贮取料时，厌氧环境被破坏，发酵饲料接触空气后，细菌、酵母菌及霉菌等有害微生物活动旺盛，出现好气性腐败，并产出大量的热，饲料中的乳酸含量迅速下降，pH上升，氨态氮浓度增加，从而破坏发酵饲料在厌氧条件下的 稳 定 性 （Liu 等 ，2013；McDonald 等 ，1991；Woolford，1990）。

本试验采用小规模发酵法，在低温条件发酵的黄贮玉米秸秆中添加不同的乳酸菌，探究其对玉米秸秆黄贮的发酵品质、微生物数量以及有氧稳定性的影响，以期筛选出低温下高效发酵乳酸菌，为低温季节或低温地区调制高品质秸秆发酵饲料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 玉米秸秆取自黑龙江八一农垦大学试验田，然后将其铡短至1~2 cm，水分调整为65%；乳酸菌由日本国立畜产基地研究所提供，分别是 LAB1（Chikuso-1）、LAB2（Master-LP）和LAB3（Master-AC）。

1.2 乳酸菌添加处理 试验处理包括一个对照组及乳酸菌 LAB1组、LAB2组、LAB3组、LAB1+LAB2组、LAB1+LAB3组和LAB2+LAB3组。采用小规模发酵法，称取300 g备用的秸秆原料，装入16 cm×25 cm的食品级聚乙烯袋内，每个处理组4袋（共28袋），真空密封后，置于4°C条件下发酵。在30 d后，每种处理各开封3袋，检测相关指标。1.3 测定项目及方法

1.3.1 发酵特性 开封后立即称取黄贮发酵的饲料样品20 g，加入180 mL灭菌水，用均质器拍打90 s使其充分混匀，再进行过滤。滤液用于测定饲料pH及有机酸。有机酸的测定：滤液经2000 r/min离心5 min，用0.22 μm滤膜过滤后，用高效液相色谱仪（色谱柱KC-811，检测器SPD-M10AVP，柱温 50°C，流速 1 mL/min，检测波长 210 nm，进样量 5 μL），检测乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。

1.3.2 微生物组成及数量 称取20 g玉米秸秆原料以及黄贮发酵后的饲料样品于聚乙烯塑料袋内加180 mL灭菌水，用均质器拍打90 s使其充分混匀，在塑料袋内取1 mL混合液，将其在灭菌的试管中依次按梯度稀释成10-1、10-3、10-5倍液，用乳酸菌培养基（MRS）、营养琼脂培养基（NA）、大肠杆菌显色鉴别培养基（BLB）、强化梭菌鉴定琼脂（DRCA）、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，分别检测乳酸菌、一般细菌和耐热菌、大肠杆菌、丁酸菌、霉菌和酵母菌。混合液涂布到培养基后，将大肠杆菌、酵母菌、霉菌、耐热性菌（滤液在75°C水浴锅中加热15 min后涂板）置于30°C恒温培养箱中培养48 h，乳酸菌、丁酸菌置于30°C厌氧培养箱中培养48 h后，分别计数（单位质量新鲜样品中微生物数量 lg cfu/g FM）（Cao等，2011）。

1.3.3 有氧稳定性试验 在发酵30 d开封后，取各个袋发酵的样品100 g，放入1000 mL无盖的聚乙烯瓶中，敞口放置，通过检测发酵饲料的温度变化，考察其有氧氧化情况。即在室温条件下，连续测试容器内饲料的温度，当饲料温度比室温高于2 °C 时，被认为发生有氧氧化（Nishino等，2004），并测定其pH、有机酸、NH3-N和微生物含量。

1.4 数据统计与分析 采用Excel软件整理基础数据后，采用SAS 9.2统计软件进行方差分析，并用Tukey法对数据进行多重比较，结果以 “平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 玉米秸秆原料的化学成分及微生物含量由表1可看出，玉米秸秆原料的干物质含量为91.28%，有机物、粗蛋白质、粗脂肪、酸性洗涤纤维及中性洗涤纤维分别为干物质含量的90.07%、5.18%、1.18%、44.86%及67.22%。同时，在玉米秸秆原料中检测到乳酸菌及耐热菌的数量达104，一般细菌、大肠杆菌及酵母菌的数量均达到107，原料中丁酸菌的数量为103。

表1 玉米秸秆原料的化学成分及微生物

2.2 乳酸菌对低温条件下玉米秸秆黄贮发酵品质的影响 由表2可以看出，试验LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的 pH 分别较对照组降低了 7.32%、8.44%、11.32%、6.95%、5.71%、8.82%（P<0.05）；其中，LAB3组的 pH 最低，为 4.65。 与对照组相比，LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的乳酸含量分别高了 18.42%、23.68%、32.46%、28.07%、16.67%、26.32%（P<0.05）。 试验 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的乙酸含量显著高于对照组（P<0.05），其中LAB3组的含量最高。各组间的丙酸含量均无显著差异（P>0.05）。LAB1、LAB2、LAB3组的丁酸含量均高于对照组，但均无显著差异 （P>0.05）。 试验 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的氨态氮浓度分别较对照组降低了 9.32%、14.20%、21.02%、10.34%、11.04%、14.20%（P<0.05）， 其中 LAB3组下降的幅度最大，为21.02%。

2.3 乳酸菌对低温条件下玉米秸秆黄贮微生物数量变化的影响 由表3可以看出，LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的乳酸菌数量均大于对照组，其中LAB3组最多，为7.91 lg cfu/g FM （P<0.05）。 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的一般细菌数量均少于对照组，其中LAB2+LAB3组最少，为6.18 lg cfu/g FM （P<0.05）。 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的大肠杆菌数量均少于对照组，其中，LAB3组最少，为3.14 lg cfu/g FM（P<0.05）。各组间的耐热菌数量均无显著差异。各组中均未检测出丁酸菌和霉菌。LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的酵母菌数量显著小于对照组（P<0.05）。

2.4 乳酸菌对低温条件下玉米秸秆黄贮有氧氧化后pH、有机酸及氨态氮含量的影响 由表4可知，在发生有氧氧化后，LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的 pH 分别较对照组降低了 13.26%、7.62%、14.19%、9.67%、10.54%、10.54%（P<0.05），其中LAB3组的下降率最高，为14.19%。 LAB1、LAB2、LAB3组的乳酸含量均显著高于对照组和 LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、组（P<0.05）。与对照组相比，LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3组的乙酸含量均显著增多（P<0.05）。各组间的丙酸和丁酸含量均无显著差异（P>0.05）。与对照组相比，LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组 的氨态氮含量均显著降低（P<0.05）。

2.5 乳酸菌对低温条件下玉米秸秆黄贮有氧氧化后微生物数量变化的影响 由表5可知，在发生有氧氧化后，LAB2+LAB3组的乳酸菌数量显著高于对照组和 LAB2、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3组（P<0.05）； LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的一般细菌数量均小于对照组，其中 LAB1组显著减少 （P<0.05）。LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的大肠杆菌数量均小于对照组，其中LAB1+LAB2组最少，但无显著差异 （P>0.05）。LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的耐热菌数量均小于对照组，其中LAB3、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的数量显著降低 （P<0.05）。LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的丁酸菌数量均小于对照组，其中LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组最少（P<0.05）。 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3组的霉菌数量均小于对照组，其中，LAB1组最少，与对照组相比差异显著（P<0.05）。

表2 低温下玉米秸秆发酵30 d的发酵品质测定结果

表3 低温下玉米秸秆发酵30 d的微生物数量检测结果lg cfu/g FM

表4 玉米秸秆发酵30 d有氧氧化后的pH、有机酸及氨态氮含量的变化

3 讨论

3.1 玉米秸秆原料的化学成分及微生物 发酵饲料成功的关键在于提供适宜的条件。为创造厌氧环境要把原料压实，而水分含量过低，不易压实，所以发酵饲料适宜的水分含量为65%~70%（Cao等，2009）。通过对玉米秸秆原料的化学成分检测发现，干物质含量为91.28%，因此，本试验通过调整水分含量为65%对玉米秸秆进行发酵。与其他常用的大豆秸秆、谷草和甘蔗梢叶等发酵饲料原料相比，本试验中使用的玉米秸秆粗蛋白质、粗脂肪和中性洗涤纤维含量较低（吴兆鹏等，2016；闫艳红等，2014；郭勇庆等，2009）。在玉米秸秆原料中检测到乳酸菌及耐热菌的数量达104，一般细菌、大肠杆菌及酵母菌的数量均达到107，丁酸菌的数量为103。主要可能与玉米秸秆原料放置时间过长后导致水分、化学营养成分和附着微生物的含量差异很大有关（Yahaya等，2002；Garcia等，1989）。

3.2 乳酸菌对低温条件下玉米秸秆黄贮发酵品质的影响 发酵饲料的pH可以反映饲料品质受腐败菌和霉菌影响的程度。玉米秸秆发酵过程中，pH下降的主要原因是乳酸菌大量繁殖产生乳酸促使发酵饲料酸度降低。王鹏等（2011）对低温条件下混合乳酸菌制剂对芦苇发酵品质的影响研究发现，4°C条件下的pH始终稳定在4.20以下，这与本试验的结果不一致，这可能是不同种类的乳酸菌活性受温度限制的程度不同。有机酸（乳酸、乙酸、丙酸和丁酸）含量及其构成比例是鉴别发酵品质的重要指标。贾军等（2017）研究发现，接种低温乳酸菌复合菌系可以明显改善玉米秸秆与马铃薯渣混合发酵饲料的品质。刘圈炜等（2013）研究发现，添加复合乳酸菌制剂可改善玉米秸秆青贮品质。王昆昆等（2010）研究发现，添加乳酸菌制剂能降低青贮的pH，提高乳酸含量，改善青贮饲料的青贮品质。Courtin等（1990）报道，乳酸是降低pH的主要有机酸，通常以乳酸在总酸中比例最高为好，这与本试验结果一致。氨态氮含量也是判定饲料品质的主要指标（刘建新等，1999）。本试验中，添加乳酸菌可以降低玉米秸秆黄贮饲料的氨态氮含量，表明添加乳酸菌使玉米秸秆附着的乳酸菌数量增多，发酵过程中产生大量的乳酸能减少早期植物蛋白酶对含氮化合物的降解作用，降低氨态氮/总氮含量，改善黄贮发酵饲料的品质（姜义宝等，2017）。

3.3 乳酸菌对低温条件下玉米秸秆黄贮微生物数量变化的影响 在发酵的好气性细菌活动阶段过后，乳酸球菌大量繁殖，迅速降低pH，促使腐败菌、丁酸菌等活动受到抑制。本试验低温环境虽然会降低乳酸菌发酵速度，但经过30 d的发酵，乳酸菌总数也维持在6.59 lg cfu/g FM及更高水平。Cao等（2011）在研究乳酸菌对菜渣发酵品质及瘤胃体外消化的影响中发现，添加乳酸菌能促进乳酸菌的繁殖，降低pH，抑制好氧性细菌、大肠杆菌、丁酸菌、霉菌及酵母菌的生长，这与本试验结果一致。未检测到霉菌，证明玉米秸秆黄贮密封良好，未发生二次发酵，否则发酵饲料会产生霉变腐败，温度上升并附着霉菌。

表5 玉米秸秆发酵30 d有氧氧化后微生物数量测定结果lg cfu/g FM

3.4 乳酸菌对低温条件下玉米秸秆黄贮有氧氧化后pH、有机酸及氨态氮含量的影响 当发酵窖打开后，发酵饲料暴露于空气中，好氧微生物分解乳酸和残余的水溶性碳水化合物 （WSC）产生CO2，同时也会分解蛋白质和氨基酸为氨或胺类物质，导致pH升高，饲料消化率降低，适口性降低（Woolford，1990）。 McDonald 等（1991）研究发现，发酵饲料暴露在空气中有机酸会明显减少，这与本研究的结果一致。Filya等（2000）在乳酸菌制剂对小麦秸秆青贮的发酵品质及有氧稳定性影响中发现，添加乳酸菌菌剂可以显著提高小麦秸秆青贮的发酵品质，提高有氧稳定性。张涛等（2007）将布氏杆菌、植物乳杆菌及两者的复合菌剂加入苜蓿青贮中发现，添加乳酸菌菌剂可以显著提高苜蓿青贮的发酵品质，延长有氧稳定性的时间。在本试验中，在低温条件下发酵的玉米秸秆黄贮饲料中添加乳酸菌均可提高发酵饲料的有氧稳定性。

3.5 乳酸菌对低温条件下玉米秸秆黄贮有氧氧化后微生物数量变化的影响 许多研究表明，酵母菌的快速大量繁殖是破坏有氧稳定性的主要原因之一 （Liu 等，2013；Wang 等，2008；McDonald 等，1991；Woolford 等，1990）。本试验中，酵母菌数量维持较高水平，可能是因为产生的乳酸可为乳酸同化型酵母菌等好氧微生物提供生长繁殖所需要的底物（郭旭生等，2006）。本试验中，有氧氧化后大肠杆菌、丁酸菌和霉菌数量均显著增多，表明饲料已经发生腐败霉变，营养价值减少，饲喂价值丧失。

4 结论

在低温条件下，添加乳酸菌制剂可有效降低玉米秸秆黄贮饲料pH，增加乳酸菌数量，抑制有害微生物的生长，改善玉米秸秆黄贮品质，同时提高玉米秸秆黄贮的有氧稳定性,其中添加乳酸菌LAB3效果最好。