粒度及粒重对“云谷1号”黑米总花色苷含量的影响

年 伟，邓 伟，张锦文，史胜利，吕永刚，叶昌荣，徐雨然，谷安宇，安 华，吕 莹，李小林

(云南省农业科学院粮食作物研究所，云南 昆明 650205)

【研究意义】花青素 (Anthocyanidin) 是维管植物最为重要的水溶性色素，属于一大类称之为黄酮类化合物的次级代谢产物，基本结构是由C6-C3-C615个碳原子构成的2-苯基苯并吡喃 (2-phenyl-benzopyrylium)，即花色基元阳离子 (图1a)，其B环3'及5'位置不同的羟基化及甲氧基化形成了6种最常见的花青素 (图1b)：天竺葵素 (Pelargonidin，Pg)、矢车菊素 (Cyanidin, Cy)、飞燕草素 (Delphinidin，De)、芍药素 (Peonidin，Pn)、矮牵牛素 (Petunidin，Pt) 及锦葵素 (Malvidin，Ma)。花色苷 (Anthocyanin) 是花青素的糖苷衍生物，由于糖苷种类、结合部位及数目的不同，种类达500多种[1]。除赋予多种水果、蔬菜、谷物及花瓣以红色、紫色和蓝色外，花色苷在植物的生殖机制如授粉、种子传播以及抵抗逆境、拒食保护等方面发挥着重要的作用。例如，能够减轻紫外光 (UV-B) 对植物的伤害，抵抗干旱和盐害[2]，响应水分胁迫和热胁迫；棉花叶片中的矢车菊素-3-葡糖苷 (Cyd 3-glu) 对烟草夜蛾 (HeliothisvirescensF.) 幼虫的生长有特别的抑制作用[3]。在食品工业中，花色苷除了能作为纯天然的食品添加剂给各种食品染色之外，还可鉴别使用了何种葡萄品种酿造红葡萄酒以及是否添加了外源性色素[4]。花色苷对人的健康有重要的营养价值和功能特性，如增强细胞的抗氧化能力从而防止低密度脂蛋白 (Low-Density Lipoprotein，LDL) 的氧化、预防心血管疾病、显著降低红细胞中过量的活性氧、抗炎及抗癌活性、控制糖尿病等[5]。【前人研究进展】黑米富含花色苷，在亚洲许多国家有着悠久的种植历史，所含花色苷主要有4种：矢车菊素-3-葡糖苷、芍药素-3-葡糖苷 (Pn-3-glu)、矢车菊素-3,5-二葡糖苷 (Cy-3,5-diglucoside) 和矢车菊素-3-芸香糖苷 (cy-3-rutinoside)，分别占91.01 %、7.13 %、0.92 %和0.94 %[6]，且绝大部分集中于只占籽粒重量8 %～10 %的糠层，该层含量超过其总量的95 %，只有不到5 %分布于胚部[7]。糙米籽粒大小与诸多碾米品质、外观品质及物理化学特性显著相关[8]，某些营养成分的含量与粒度的关系也有报道，如较厚的糙米含有更高浓度的生育酚、生育三烯酚和γ-谷维素[9]；黄酮含量与籽粒长度和长宽比正相关，与百粒重呈负相关[10]；较薄的籽粒含有较高含量的蛋白质、脂质、纤维和灰分[11]。【本研究切入点】黑米粒度与花色苷含量的相互关系还未见报道。【拟解决的关键问题】众所周知，重量相同的颗粒物，三维尺寸越小，表面积越大。加之黑米花色苷主要分布于糠层，由此产生了疑问，粒度不同但重量相同的黑米，花色苷含量是否也大致相等呢？还是颗粒较小的黑米含有更多的花色苷？另一方面，花色苷的萃取和纯化不仅耗时，而且对环境条件的要求较高，能否依据籽粒大小和重量建立模型而快速有效地对黑米花色苷含量进行评估呢？

图1 花色基元阳离子(a)及花青素(b)的基本结构Fig.1 The structure of 2-phenyl-benzopyrylium (a) and Anthocyanidin (b)

1 材料与方法

1.1 材料

云谷1号为云南省农业科学院粮食作物研究所选育的粳型黑米 (OryzasativaL. ssp.japonica)。2016年10月收获于云南省曲靖市罗平县 (24°51′N, 104°17′E, 1500 m a.s.l.)，自然干燥至水分含量13 %，-10 ℃避光保存。样品脱壳后使用LA-LS种子分级机 (Westrup，DK)分为6个厚度区间 (组)：<1.50 mm、1.50～1.70 mm、1.70～1.80 mm、1.80～1.90 mm、1.90～2.00 mm、>2.00 mm，随机测量各区间100粒的粒长、粒宽、粒厚和粒重，重复3次。实验中使用了Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO, USA)的高效液相色谱级甲醇 (MeOH)，Waters (Milford, MA, USA) C18层析柱(6cc, 500mg silica sorbent)，Whatman no.1定性滤纸(110 mm，圆形)，以及分析纯氯化氢 (HCl)、氯化钾(KCl)、乙酸钠 (CH3CO2Na·3H2O)、乙酸乙酯 (Ethyl Acetate)。酸化甲醇和酸化去离子水含0.01 % (v/v) HCl。

1.2 花色苷的萃取和纯化

花色苷的萃取和纯化参照Rodriguez和Wrolstad[12]的方法进行并作适当改动。精确称量1 g样品研磨成粉，加入50 mL酸化甲醇常温下避光浸泡1 h。重复萃取3次后真空抽吸过滤悬浮液，40 ℃下旋转蒸发除去甲醇后将色素溶于酸化去离子水。水溶物经C18柱吸附后，分别用12 mL酸化去离子水和乙酸乙酯洗去未被吸附的化合物 (糖类、酸类) 以及吸附的多酚类化合物 (酚酸、黄酮醇) ，最后以酸化甲醇溶解被吸附的色素。再次旋蒸除去甲醇后将色素溶于20 mL酸化去离子水备用。

1.3 测定及计算方法

pH示差法用于测定1.2制备的溶液吸光度值，以公式 (1) 计算总花色苷含量 (Total anthocyanin content, TAC)。

(1)

式中，A=(A512nm-A700nm)pH1.0- (A512nm-A700nm)pH4.5，稀释样品的吸光度差值；MW=449.2 g/mol，Cy-3-glu的摩尔质量；DF=6，稀释因子；Vw=20，溶解花色苷的酸化去离子水体积；ε=26 900 L/mol cm，Cy-3-glu的摩尔吸光系数；1为比色皿光路长度，单位cm。总花色苷含量表示为Cy-3-glu。实验中扫描了从240～700 nm波长范围的吸光度值，最大吸光度波长 (λvis-max) 在512 nm处。

表1 不同厚度区间籽粒外形、百粒重与总花色苷含量值

注：样本均值以平均值±标准差表示；粒厚、粒宽、粒长、体积和表面积n=300，百粒重和TAC n=3；同列不同字母表示差异显著 (P=0.05，SNK多重比较)。

Note： Data of samples express as mean± SD. Thickness, Width, Length, Volume and Surface area n=300, 100-grain weight and TAC n=3. Different letters in the same column are significantly different (P=0.05, Student-Newman-Keul's multiple range test).

单粒黑米籽粒的体积 (V) 和表面积 (S) 依据Jain和Bal的方法[13]分别以公式 (2) 及公式 (3) 计算：

(2)

(3)

1.4 分析方法

描述统计、Student-Newman-Keuls多重比较、两两相关分析和共线性诊断使用SPSS v22.0 (IBM, USA)软件完成，偏最小二乘 (Partial least squares, PLS) 分析及回归使用SIMCA v14.1.0 (Umetrics, Sweden)完成。

2 结果与分析

2.1 籽粒外形、百粒重与总花色苷含量

云谷1号籽粒宽度、长度、单粒体积和表面积、百粒重以及TAC随籽粒厚度的增加而增加，各区间的厚度、宽度、体积和表面积差异显著；1、2组间，2、3组间粒长差异不显著；百粒重除5、6组间差异不显著外，其它各组间差异均显著；TAC 2组与3组，3～6组的组间差异不显著 (表1)。

所有厚度区间的云谷1号TAC平均为97.2～193.8 mg/100g。值得注意的是，厚度小于1.70 mm的籽粒相对百分比9.6 % (第1～2组)；超过1.70 mm后 (第3～6组，相对百分比90.4 %)，TAC差异不显著，但与之相应的粒厚、粒宽和粒长差异却是显著的，平均TAC高出第1、2组48.9 %。尽管单个籽粒的体积和表面积随着三维值的增加而增加，但就同等重量的样品来看，因为粒数的不同其总的体积和表面积会有不同，粒度较小的籽粒其总体积和总表面积会更大，显示尽管粒度较小的籽粒具有更大的表面积，但其充实度低于较大的籽粒。

2.2 粒度、百粒重和TAC之间的相关性

实验涉及的几个参数与TAC均为正相关关系，所有变量中，粒厚与TAC的相关度最高 (r=0.922)，其次为百粒重 (r=0.911)、粒宽 (r=0.882)，最后是粒长 (r=0.753) (表2)。

表2 各因素间两两相关系数

注：** 在0.01水平上显著。

Note： ** is significant at 0.01 probability level.

图2 t1/t2得分图 (a) 和权重图 (b)Fig.2 PLS t1/t2score plot (a), weight plot (b)

此外，4个变量彼此间具有较高的正相关关系，相关系数0.879～0.993 (P< 0.01)，表明4个变量间可能存在多重共线性。方差膨胀因子 (The Variance Inflation Factor, VIF)常被用来诊断多重共线性 (Multicollinearity)，若VIF值高于10，则存在明显的多重共线性，会显著地影响参数估计的稳健性。多元线性回归结果显示，VIF值14.0～120.85，回归系数中出现了负值 (粒厚-2.968，粒长-0.519)，这一结果违背常理，同时表明这四个因子间确实存在多重共线性并影响了回归结果。

2.3 PLS分析及回归

在处理多元变量或者变量间具有共线性响应特性时，偏最小二乘 (Partial Least Squares, PLS) 为探究更为复杂的变量问题以及分析变量数据提供了现实可行的方法。以粒厚、粒宽、粒长和百粒重为X变量，TAC为Y变量建立PLS模型，得到2个主成分，分别解释了99.6 %的X变异 (R2X) 和87.3 %的Y变异 (R2Y)，预测率为83.6 % (Q2，即“交叉验证”后的R2) (表3)。

在SIMCA软件中，t和u可视为从原变量(x，y)提取的新的潜在变量，是原变量在主成分平面投影的向量，最大限度地携带了原变量所包含的信息，同时自变量t对因变量u又具有最强的解释能力。从1/t2得分图和T2椭圆可以看出(图2a)，18个样本点 (3个点为一组，代表某一厚度区间的3次重复，如1～3为<1.50 mm的3次重复) 均分布在椭圆内，没有异常值。1～9 (厚度小于1.80 mm) 的组间差异明显，占据了水平方向的左边；10～18 (厚度大于1.80 mm) 占据了水平方向的右边，组间差异不如1～9明显，组内差异也小于1～9。表明当厚度超过1.80 mm后，粒度、百粒重和TAC都明显较高，7～9 (1.70～1.80 mm) 则处于中间过渡态。

PLS模型的权重图 (图2b) 表明，四个因子均正相关于应答因子TAC，影响力度从大到小依次为粒厚、百粒重、粒宽、粒长。粒厚、百粒重和粒宽3个因子有较强的相关性，与粒长有一定的相关性，任何一个因子的变化都会引起其它3个因子发生变化。从图2b还可看出，粒厚对百粒重的影响最大，其次是粒宽，最后是粒长。

t/u平面图常被用来判断自变量与因变量之间的相关关系。t1/u1(图3a)比t2/u2(图3b)更具有明显的线性关系 (图3a)，尽管t2/u2也呈现出了一定的线性趋势，但是样本点分布较为松散。因此，主成分1已经具有足够的能力解释原变量的变异 (R2X=0.963)，并且，t1/u1明显的线性关系也表明使用主成分1来建立线性模型是合理的。

表3 PLS模型的解释率和预测率

注：观察值 (N)=18，变量 (K)=5 (X=4,Y=1)。

Note： Observations (N)=18, variables (K)=5 (X=4,Y=1).

图3 t1/u1 (a) 与t2/u2 (b)平面图Fig.3 t1/u1 (a) and t2/u2

图4 PLS模型VIP图 (a) 和响应置换图 (b)Fig.4 The VIP plot (a) and the Permutation plot (b) of the PLS model

加入主成分2以后，粒长的回归系数变为了负值 (表4)。结合PLS模型的权重图 (图2b)，表明主成分2对粒长的影响比主成分1更大，并且与之负相关。

基于上述分析，使用第一主成分来建立原始变量回归方程是可行的：

y=13.121+0.425x1+0.600x2+0.378x3+0.190x4

(4)

回归方程 (4) 中的y是一个基于原变量并与之线性相关的新的综合变量，解释了原变量78.8 %的变异 (表3)，可视为基于粒度和粒重的云谷1号黑米花色苷含量综合评估指数。变量投影重要性 (Variable Influence on Projection, VIP) 用来描述新变量解释原自变量及原自变量与因变量关联性的重要程度。如果VIP值大于1，表明该变量是“重要”变量；VIP值小于0.5表明该变量是“不重要”的变量；VIP值介于0.5～1之间是灰色区域，其重要程度依赖于数据集的大小。主成分1的VIP值从粒厚1.06，百粒重1.05，粒宽1.01到粒长0.87逐渐递减 (图4a)，表明粒厚、百粒重及粒宽在构建TAC时均为重要因子，其重要性高于粒长，这一结果与表2所列结果一致。

虽然表3已列出了PLS模型的解释能力和预测能力，但交叉验证的一个缺陷是仅评估了模型的解释能力和预测能力而没有考察其统计显著性[14]。响应置换 (Response Permutation)是SIMCA软件中一个能够评估PLS模型解释率 (R2) 和预测率 (Q2) 显著性的有用工具。图4，b显示了以TAC为应答因子的100次置换结果，模型的R2Y和Q2Y值均大幅度地高于相应的置换值，并且R2Y的Y截距为-0.0914 (没有超过0.3～0.4)，Q2Y的截距为-0.214 (没有超过0.05)，表明PLS模型是有效的[14]。

表4 PLS模型回归系数(P =0.05)

注：** CoeffCS表示原自变量X进行了中心化和标准化，因变量Y进行了标准化但没有中心化。Coeff表示原变量没有进行中心化和标准化，方括号内的数字表示使用主成分1或者同时使用主成分2。

Note： ** CoeffCS means regression coefficients corresponding to the centered and scaledX, and scaled but uncenteredY. Coeff means regression coefficients corresponding to the unscaledXandY. The number in square brackets means comp.1 or 2 components used at the same time.

3 讨 论

花色苷和其它化合物(辅色素)的共色作用是植物色彩稳定的主要机理。辅色素通常无色，但是同花青素溶液混合后相互作用产生增色效应而导致吸收光谱的红移[1,15]。另一方面，B环羟基被糖取代则会引起可见光谱的蓝移效应，随着糖苷数目的增加，最大吸收峰波长值越来越短。如Cy-3, 5-二糖苷在盐酸甲醇溶液中于526 nm处有最大吸收峰，3, 3′-二糖苷在519 nm以及3, 5, 3′-三糖苷在518 nm处有最大吸收峰[4]。Jurd和Asen[16]报道了Cy-3-glu在pH 1.0溶液中λvis-max位于510 nm处，但云谷1号花色苷位于512 nm处，共色作用可能对此产生影响。Abdel[17]的实验结果显示基于矢车菊素化合物的λvis-max范围从512～520 nm。因此，实验中检测到的最大可见吸收波长为512 nm是可靠的。

稻穗由许多分支构成，含有2种极端类型的籽粒，即强势粒和弱势粒，通常由籽粒的重量所决定，与小穗的位置和开花顺序有关。一般情况下，粒重从穗部自上而下递减，就胚乳细胞的分裂和籽粒灌浆速率来看，开花较早的强势小穗比后开花的弱势小穗更具有优势[18]。换言之，强势粒和弱势粒的粒度表现存在着明显差异，云谷1号粒度的差异在一定程度上也反映了这种现象。粒度是决定谷物产量的关键因素之一，并且前已述及，某些营养素浓度与粒度大小有密切联系，既有正相关也有负相关，不同粒度云谷1号糙米籽粒TAC的差异可被视为强、弱势粒TAC的差异。碳代谢过程中，糖的累积对黑米淀粉和花色苷的生物合成发挥着重要作用[19-20]，营养物质的再活化会影响淀粉合成，进而在谷物花色苷的生物合成中发挥潜在作用。基于以上分析，云谷1号籽粒发育过程中，花色苷的累积和碳水化合物 (淀粉、糖)的累积应该是一致的。但到目前为止，强势粒和弱势粒营养物质累积差异的生理和分子机理尚未完全清楚，是因为强、弱势粒间碳水化合物的分布不均而导致的TAC差异？或是其它原因？笔者的实验仅仅只是揭示了表面现象，尚需更深入地研究。

4 结 论

云谷1号糙米粒度、粒重与TAC均为正相关关系，影响力从大到小依次为粒厚、百粒重、粒宽、粒长，前三者是影响TAC的重要因素。粒厚超过1.80 mm后，TAC的差异不显著。尽管同等重量而粒度较小的云谷1号糙米籽粒具有更大的总表面积，但总花色苷含量低于粒度较大的籽粒。粒度的差异不但直接体现了粒重的差异，还体现了TAC的差异。并且构成粒度的3个因素间，以及这3个因素与粒重间存在多重共线性。

由于某些原因，实验只使用了一个产地、一个生长周期的云谷1号黑米样本，导致实验结果不具有普遍代表性，但对依据粒度、粒重等参数建立某些营养物质含量的评价指数和预测模型具有一定的参考价值。