河车壮儿膏改善实验小鼠免疫功能的药效学研究*

李正宇 喻雄华# 谌章和

1 湖北省仙桃市中医医院 湖北 仙桃 433000

2 湖北中医药大学 湖北 武汉 430065

气阴两虚体质的小儿在日常诊疗中是比较常见的，小儿常因体虚或病后调养不当而造成反复呼吸道感染，影响其健康成长。河车壮儿膏是我院针对气阴两虚患儿进行调养的验方，由紫河车、当归、黄芪等28味中药组成。为弄清该药的治病机理，实验小组针对气阴两虚小儿抵抗力差、易患呼吸道反复感染特点，进行了以下河车壮儿膏的药效学系列实验。

1 实验材料

1.1 药物:河车壮儿膏，300ml/瓶，鄂药制字Z20180598，仙桃市中医医院制剂室生产，批号:20180303；黄芪颗粒，8g/袋，国药准字Z20153620，湖北诺得胜制药有限公司，批号:20180712。

1.2 试剂:环磷酰胺(CTX)200mg/支，江西九州制药厂，批号:2010102；肝素钠1250万U/支，武汉生化制药有限公司，批号20170309；0.9%NaCl，科伦药业有限公司，批号:20170102；姬姆萨染液，Sigma，自配；CRBC悬液，按文献方法配制[1]；豚鼠血清，0.3克/支:中国药品生物制品检定研究院，批号20171024；2，4-二硝基氯苯，Aldrich Chemical Co．Ltd；脱毛剂，广东宝洁公司，失效期2019年4月；甲醇、丙醇均为分析纯。

1.3 动物:雄性小鼠（Balb/c），8周龄，共120只。由武汉大学动物实验中心提供，合格证号:SYXK（鄂）2014-0013，层流架内饲养。

1.4 仪器设备:Olympus显微镜；台式离心机，Tcl-16G；紫外分光光度计 LNG721；37°恒温箱 NAPCO5410；METTLER TOLEDO电子分析天平AL204型；Sartorius；打孔器，KW-trio97AO。

2 河车壮儿膏对小鼠巨噬细胞吞噬功能的作用

2.1 分组:雄性小鼠（Balb/c），8周龄，40只，随机分为正常组、CTX组、黄芪颗粒组、河车壮儿膏组4组，每组10只。

2.2 给药:小鼠给药剂量以人与实验动物之间药物剂量公式换算其中D为药物剂量，W为体重，K为常数。取人用量的20倍作为实验小鼠的用药剂量。正常组和CTX组以纯净水灌胃，剂量0.5ml/次；黄芪颗粒组以黄芪颗粒水溶物灌胃，剂量20mg/g·d；河车壮儿膏以样品灌胃，剂量0.32ml/g·d，每日2次，共14天。

2.3 制造模型:从第10天起，CTX组、黄芪颗粒组和河车壮儿膏组皮下注射CTX 40mg/kg·d，每日1次，共3天。

2.4 实验方法:给药第14天后，分别按0.4ml/只剂量腹腔注射5%鸡红细胞悬液（CRBC）溶液，8h后处死小鼠，剪开腹部，用0.9%生理盐水冲洗后吸出，离心5min。将细胞悬液混匀后，将滴到玻片上，3min后以1∶1丙酮甲醇液固定5min，姬姆萨染液染色，晾干后置显微镜下观察，计数巨噬细胞，每片计200，计算吞噬指标。

2.5 结果:河车壮儿膏组和黄芪颗粒组小鼠的腹腔巨噬细胞对CRBC的吞噬指标均高于CTX组（P＜0.01），说明实验样品和对照品黄芪颗粒均有促进CTX组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的效果；河车壮儿膏与黄芪颗粒比较未见显著性差异（P＞0.05），结果见表1。巨噬细胞吞噬鸡红细胞形态学结果见图1。

表1 壮儿膏对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（±s）

表1 壮儿膏对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（±s）

注:与CTX组比较，*P＜0.05 ，**P＜0.01。

0.199±0.039*0.136±0.045 0.226±0.066**0.220±0.080**37.4±5.93*25.2±11.85 46.3±7.65**43.4±16.92**CTX组黄芪颗粒组10 10

图1 巨噬细胞吞噬鸡红细胞形态学

3 河车壮儿膏对2，4-二硝基氯苯（DNCB）引起的小鼠迟发性超敏反应的影响

3.1 方法:分组、给药、制造模型同上。在首次给药后第4天，各组小鼠用脱毛剂脱毛后，滴丙溶液致敏（5.0%，DNCB 20μl/只）。给药第14天后，在小鼠左耳涂抹2.5%DNCB丙酮溶液，涂药剂量为20μl/只，致小鼠迟发性过敏。24h后处死，用打孔器在左右对称部位打出耳片，直径约8mm，称重，以左右耳片重量差表示过敏反应的强度。

3.2 结果:河车壮儿膏组和黄芪颗粒组小鼠的取片重量与CTX组比较有显著性差异（P＜0.01），提示河车壮儿膏和黄芪颗粒对CTX引起免疫功能降低小鼠对DNCB所致迟发性超敏反应有增强作用；河车壮儿膏与黄芪颗粒比较无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

表2 河车壮儿膏对DNCB丙酮溶液所致小鼠的迟发性超敏反应的作用（±s，mg）

表2 河车壮儿膏对DNCB丙酮溶液所致小鼠的迟发性超敏反应的作用（±s，mg）

注:与CTX组比较，**P＜0.01。

10 CTX黄芪颗粒组17.28±1.**12.79±3.92 17.24±3.43**18.48±3.20**

4 河车壮儿膏对鸡红细胞致敏小鼠溶血素抗体生成的作用

4.1 方法:分组、给药、制造模型同上。从给药后的第4天起，各组小鼠按0.4ml/只剂量腹腔注射5%鸡红细胞悬液。所有实验组给药后第14天，从眼球取血，置于管中，室温下放置1h后离心（2000r/min），10min后取血清，用0.9Nacl稀释100倍后取lml，与5%鸡红细胞悬液0.5ml、豚鼠血清0.5ml混合，37℃置保温30min后，再置于0℃冰箱30min，取出离心后取上清液，用分光光度计比色，选择波长540nm。另用0.9%NaCl做空白对照，取上清液作为比色基准。以光密度值为指标计量血清溶血素。

4.2 结果:壮儿膏组和黄芪颗粒组小鼠的血清溶血素含量高于CTX组（P＜0.01），表明河车壮儿膏和黄芪颗粒对CTX引起免疫功能下降小鼠溶血素抗体产生有较明显促进作用；河车壮儿膏与黄芪颗粒间无显著性差异（P＞0.05）。见表3。

表3 壮儿膏对鸡红细胞致敏小鼠血清溶血素抗体产生的作用（±s）

表3 壮儿膏对鸡红细胞致敏小鼠血清溶血素抗体产生的作用（±s）

注:与CTX组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

A 0.25±0.06*0.20±0.03 0.28±0.05**0.30±0.07**CTX组黄芪颗粒组10 10

5 结语

现代医学的研究表明，儿童反复呼吸道感染与其免疫功能的降低有非常显著的相关性。河车壮儿膏从培育小儿正气的角度出发来增强小儿对疾病的抵抗力，这与现代医学所阐明的呼吸道反复感染与小儿免疫功能的关系是一致的。本研究结果显示，河车壮儿膏能促进CTX引起免疫功能降低小鼠的巨噬细胞吞噬功能的作用；能增强CTX引起免疫功能降低小鼠的迟发性超敏反应；能促进CTX引起免疫功能下降的小鼠溶血素抗体生成。以上实验从药效学的角度证实了河车壮儿膏具有益气养阴的功效，可用于调理气血两虚证小儿呼吸道反复感染病症。