差异表达的miR-181a-5p、miR-141-3p在青海藏族肺结核诊断中作用

久 太 颜然然 冯喜英 刘洪千 安文静 李玉红

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染肺组织引起的肺结核。给患者带来生理上影响健康，经济压力加大，并在社会上传染扩增等问题。我国结核发病重灾区主要分布于中西部地区[1-4]，而藏族作为西部高海拔地区主要少数民族，肺结核的检出率明显高于其他民族[5]。这种现象可能与藏族人群特有的遗传因素、生活环境等有关。但目前机制尚不明确。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一段由内源性基因转录而来的长度约20～24 bp的单链小分子非编码RNA，在转录后水平对靶基因进行调控，从而调节机体的发育、免疫调节、细胞增殖、分化和凋亡等[6]。MTB感染后的病理生理过程中，miRNA可能通过调控信号转导通路中关键部位的靶基因[7]，影响宿主的先天性免疫反应和获得性免疫反应，导致炎性疾病发生[8]。本研究选用miRNA基因芯片法、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法对青海地区藏族结核及潜伏感染者血清中差异表达的miRNA进行比较分析，并筛选出差异性表达的目的基因。

材料与方法

一、研究对象

选取2016年1月至2017年12月收治于青海大学附属医院呼吸科、青海省第四人民医院结核科感染科经临床确诊为肺结核的患者50例(结核组)，潜伏感染者48例(感染组)，以及同期在院内体检的健康者50例(健康对照组)，入组者均为长期居住于青海的藏族。结核组50例，其中男性30例，女性20例，平均年龄(38.78±14.57)岁；感染组48例，其中男性25例，女性23例；平均年龄(37.44±17.0)岁；健康组50例，其中男性24例，女性26例，平均年龄(37.54±13.13)岁。各组人员年龄、性别经统计学处理无差异，具有可比性。诊断纳入标准为《中华人民共和国卫生行业标准(WS288-2008)肺结核诊断标准》[9]。排除标准：罹患慢性肝炎、HIV、高血压、糖尿病、肿瘤等慢性疾病患者。经患者本人同意后抽取晨起空腹静脉血2.5 ml用于实验研究。

二、主要仪器与试剂

实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，Thermo NanoDrop2000C 核酸检测仪(美国Thermo公司)，超低温冰箱(美国Thermo Fisher Scuentific公司)，离心机(5810R，德国eppendorf公司)，PCR仪(6325，德国eppendorf公司)，RNA血样试管PAXgene RNA Tubes ( 货号：762165，美国BD公司)， miRNA提取试剂盒 PAXgene Blood RNA Kit(货号：763134，德国QIAGEN公司)，miScript II RT Kit ( 货号：218160，德国QIAGEN公司 )，实时荧光定量PCR试剂miScript SYBR Green PCR Kit(货号：218073，德国QIAGEN公司)，Human miFinder miscript miRNA PCR芯片(货号：MIHS-001ZA,德国QIAGEN公司)。

二、实验方法

1. 血液采集： 受试者于晨起空腹时用PAXgene RNA Tubes采集2.5 ml静脉血，轻柔混匀，-80 ℃保存备用。并记录相应信息资料。

2. 血浆miRNA提取： 采用Qiagen miRNeasy PAXgene RNA Kit 提取循环RNA。产物纯度等采用Thermo核酸检测仪测定。鉴于miRNA易于降解，提取的各miRNA储存于-80 ℃，实验过程中尽量避免反复冻融。

3. PCR阵列芯片检测miRNA表达： SYBR Green荧光染料结合到双链DNA的沟槽里后发出荧光，通过检测荧光度来计算扩增量，相对定量计算各miRNA的表达量。采用SYBR Green qPCR Mastermix试剂盒进行实验，按照实验说明书配置反应体系，待逆转录引物、反应底物、酶，等比混匀后加入miRNA模板并混匀，离心以收集反应液使之聚于试管底部。普通PCR仪eppendorf 6325-PCR逆转录合成cDNA，反应条件为37 ℃、60 min，85 ℃、5 min。稀释cDNA后qPCR法测反应结果Ct值。cDNA溶液-20 ℃保存，避免反复冻融，避免污染。

Human miFinder miscript miRNA PCR芯片筛选差异表达miRNA。以逆转录合成的第一链cDNA为模板进行芯片检测。按照实验配比移取反应底物、聚合酶、SYBR Green荧光染料、PCR引物并混匀后配比移取模板cDNA，在室温条件下于平衡好的96孔 qPCR芯片上样。ABI7500荧光定量PCR仪进行荧光检测，选择Quantitation-comparative Ct程序，反应条件设定为95 ℃，10 min激活DNA聚合酶，循环阶段采用95 ℃，10 s变性；62.5 ℃，20 s退火，使反应酶与模板结合，准备基因逆转录；72 ℃，10 s延伸复制，设定40个循环，并在延阶段进行荧光检测。

4. qRT-PCR验证： qPCR检测结果中筛选出FC较大的miRNA进行实时荧光定量PCR验证。提取的RNA逆转录后采用SYBR荧光染料兼性定量检测。选取U6作为内参，反应条件设定为95 ℃，15 min；94 ℃，15 s；55 ℃，30 s；70 ℃，30 s。采集荧光检测信号统计分析。

三、统计学方法

结 果

一、miRNA提取的质量与数量

提取获得miRNA共148份，所有纳入研究对象的基本信息如表1所示。经Thermo Nanodrop2000C核酸检测仪进行质量检测，结果表明A260/280均>1.8，提取的miRNA样品纯净，miRNA含量>30 ng。所提取的miRNA符合芯片检测和qRT-PCR检测的要求。

表1 研究对象一般资料

二、血浆miRNA芯片PCR阵列检测结果

提取的各miRNA的OD值及浓度均达到实验要求，分析青海地区高海拔藏族结核组、感染组与对照组血浆中miRNA 表达结果，设定检验CT值为35，差异表达倍数(Fold Change,FC)>2[10]。基因芯片PCR阵列检测结果显示：结核组较对照组高表达的基因有1种，低表达的基因有6种。感染组较对照组基因高表达6种，低表达1种。其中miR-181a-5p在结核组中结核患者与健康对照组比较FC=0.1874，P=0.0001；感染组与健康组对照组比较为FC=0.2243，P=0.0057。miR-141-3p在肺结核组与对照组比较FC=0.1293，P=0.0355，感染组为FC=0.3117，P=0.17194。按照数据分析所得的差异表达结果见表2。分析结果散点图分析结果如图1所示；结果数据火山图分析结果如图2所示。整理结果部分表达如表2所示。

图1 差异表达miRNA的散点图

图2 差异表达miRNA的火山图

表2 差异表达miRNA谱

三、血浆miRNA样品的qRT-PCR验证结果

miRNA表达谱检测结果显示高海拔地区藏族肺结核组与低海拔地区藏族肺结核患者组相比，miRNA表达具有显著性差异。筛选出特异性低表达基因并参照张卫芳研究结论选取差异表达倍数较大的miRNA验证miR-181a-5p、miR-141-3p ，以U6为内参。其中miR-141-3p引物为：F：5′-GCGG CGGT AACA CTGT CTGG-3′，R：5′-AACG CTTC ACGA ATTT GCGT-3′；miR-181a-5p序列为F: 5′-AACA TTCA ACGC TGTC GGTG AGT-3′，R: 5′-GACC TGTA CCGC GATC GGTG AGT-3′；U6引物序列为F: 5′-CGAG CACA GAAT CGCT TCA-3′，R: 5′-CTCG CTTC GGCA GCAC ATAT-3′。计算采用 Ct(样本基因)减去Ct(内参基因)计算出样本ΔCt，再将各试验组样本ΔCt减去对照组ΔCt，对所得的结果取其相反数，得到-ΔΔCt。此时所得结果有正负数不同的结果，mRNA表达量增加、上调则结果为正值，反之则为负值，用-ΔΔCt表示表达量的柱形图如图4所示。QIAGEN公司软件分析结果显示高海拔地区藏族肺结核患者血中miRNA表达趋势与芯片PCR阵列检测结果一致。

四、目的miRNA生物信息学分析

针对研究的miR-181a-5p、miR-141-3p进行生物信息学分析，各miRNA均通过milWalk、FunRich、TargetScans软件平台分析后得出各基因功能等预测结果，其中miR-181a-5p生物信号通路分析结果提示其在白细胞介素-3(interleukin 3, IL-3)、IL-5、干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)的生物通路上发挥作用，此外还作用于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、VEGR受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate, S1P)等通路上，且P<0.05；miR-141-3p的分子功能上主要作用于调节转录因子活性、转移酶活性方面，同时miR-141-3p调节的生物信号通路主要为IL-3、IL-5、IFN-γ和VEGF等。

讨 论

青海地区低气压低氧含量，昼夜温差较大，基础卫生设施薄弱、人群疾病防控意识欠佳，尤其是偏远牧区，加之近年来旅游业的发展、人员流动量大等，导致该地区肺结核发病率明显增高[5]。但参与炎症反应的miRNA在分枝杆菌感染高海拔藏族患者的病理生理过程中扮演着怎样的角色尚不明确。本文为探究青海省地区藏族肺结核患者、潜伏感染者及体检健康者血中miRNA的表达情况，进行了基因芯片筛选实验，初步获得14种差异表达miRNA，从高表达的基因中筛选出藏族肺结核患者表达差异较大且有统计学意义的两个基因，即miR-181a-5p和miR-141-3p，且miR-181a-5p靶基因主要集中于NF-κB等结核感染后免疫相关的信号通路上。本研究结果提示青海地区藏族肺结核组与感染组、健康对照组血浆miRNA表达谱存在明显的差异，其可能通过调控免疫系统相关靶基因发挥作用[8]。

结核分枝杆菌入侵机体后，释放的内毒素(主要为脂多糖LPS)与TLR 4结合。Toll样受体(toll like receptor, TLR)作为巨噬细胞表面主要受体可以识别MTB信号，激活的TLR 4通过细胞内髓样分化因子88(myeloid differentiation, MyD88)或β干扰素TRI结构域衔接蛋白(TRIF)途径激活核转录因子Kappa B(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)进而发挥抗炎、抗菌效应[11]。Kim等[12]发现MTB感染宿主细胞后免疫应激顺势激活MAPK信号通路，依次调节信号通路上下游的TNF-α、IL-10和单核细胞趋化因子单核细胞化学趋化蛋白-1(mononuclear chemical chemoproteins, MCP-1)等细胞因子的合成分泌，进而增强或抑制免疫细胞抗结核活性。该过程受多种miRNA通过不同的机制调控。

本研究中miR-181a-5p在活动期结核组与结核潜伏感染组中均低表达且有统计学意义，而miR-141-3p仅在活动性肺结核组高表达，潜伏感染中无差异表达。通过本研究并结合相关国内外文献报告，我们发现miR-181a与TLR mRNA 3`UTP直接结合，通过阻遏其翻译基因表达，使TLR表达下调，进而负向调控THP-1巨噬细胞表达炎症介质[13]。正常情况下，巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后极化，通过呼吸爆发形成大量具有很强氧化活性和细胞毒性的反应性氧中间物(reactive oxygen intermediate, ROI)来杀灭胞内结核分支杆菌。同时，被激活的巨噬细胞可产生较多的诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase, iNOS)，在存在四氢生物蝶呤情况下将底物L精氨酸催化产生胍氨酸和一氧化氮(NO)[14]，NO具有强大的杀菌功能和细胞毒性，参与到抗感染早期的非特异性杀伤过程中，清除入侵机体的MTB。多种信号分子和转录因子参与调节巨噬细胞的极化过程[15]，PPARγ在该过程中与STAT6结合，发挥核激素受体超家族转录因子的作用，介导IL-4诱导的STAT6信号通路激活M2型巨噬细胞的极化，miRNA调控M1型巨噬细胞极化。有研究者认为miRNA(miRNA-130b)作为巨噬细胞激活的调控因子，通过与PPAR-γ的mRNA-3UTR结合，抑制PPARγ的基因的转录翻译，降低PPARγ蛋白产生量，抑制M2型巨噬细胞成熟，阻滞巨噬细胞的极化过程，减少炎性细胞因子的分泌，提高巨噬细胞的抗原提呈和杀伤胞内病菌[16-18]。被吞噬的结核杆菌在巨噬细胞内能够通过特定途径躲避机体的杀伤作用，有学者发现miRNA通过调节热休克蛋白(heat-shock proteins, HsPs)使MTB滞留于巨噬细胞内，躲避机体免疫作用的追杀[19-20]。miRNA通过调节热休克蛋白、IL-8使MTB滞留于巨噬细胞内躲避宿主免疫杀伤，使结核分支杆菌感染后更易发病[21]。因此，不管活动期肺结核还是潜伏感染的肺结核患者，其在结核分支杆菌感染侵入机体后均可引起机体免疫应答，刺激miR-141-3p受影响而出现该现象。

另有研究发现miR141-3P除在各种恶性疾病、肠易激综合征等中发挥作用外，也可通过转录后调控CXCL12来调控炎症反应而发挥作用[22-25]，可能调控途径不同而仅在活动性肺结核中具有差异性表达，详尽机制有待进一步探究。因此miRNA抑制MTB感染后巨噬细胞的成熟，可减弱或抑制促炎因子、趋化因子的分泌能力，降低NO的分泌，使NK细胞、淋巴细胞等的激活被阻滞，削弱了感染机体早期对结核分支杆菌的免疫应答，降低清除感染的MTB能力导致感染扩散。

综上所述，青海藏族肺结核组miR-181a-5p、miR-141-3p较健康对照组低表达，且均具有统计学意义。根据研究结果，我们推测这些特异表达的基因有可能成为高海拔地区藏族人群结核病的生物标志物，且仅有miR-181a-5p表达的时候可能为结核潜伏感染，而miR-181a-5p与miR-141-3p同时表达的时候则可能为活动性结核感染可能。