空通气孔同源框2过表达对人腺癌A549细胞增殖及转移的影响

王 斌,张 逊

(1.天津医科大学第四中心临床学院 300140;2.天津胸科医院 300095)

空通气孔同源框2(empty spiracles homeobox 2,EMX2)是人类与果蝇ems(empty spiracles)的同源结构域基因,含同源转录因子[1]。EMX2作为抑癌基因在结直肠癌中低表达，与肿瘤患者远处转移及预后不良有密切关系[2]。目前研究已经证实，腺癌A549细胞与肺癌的增殖和转移密切相关[3]。因此,在本研究以腺癌A549细胞系为研究对象,利用慢病毒转染技术,使腺癌细胞系中EMX2基因过表达，观察其对A549细胞的增殖及浸润影响,为临床治疗非小细胞肺癌提供一种新的途径。

1 材料与方法

1．1材料 腺癌A549细胞株购自美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自北京鼎国生物技术有限责任公司，EMX2过表达慢病毒载体由北京合生基因科技有限公司合成并构建。

1.2方法

1.2.1慢病毒转染 过表达慢病毒载体购自北京合生基因科技有限公司，转染过程严格按照说明书进行。

1.2.2荧光定量聚合酶链反应(PCR) 严格按照试剂盒说明书操作。β-actin：上游引物5′-ACC ACA GCT GAG AGG GAA ATC G-3′，下游引物5′-AGA GGT CTT TAC GGA TGT CAA CG-3′；EMX2：上游引物5′-GTC CCA GCT TTT AAG GCT AGA-3′，下游引物5′-CTT TTG CCT TTT GAA TTT CGT TC-3′。反应条件:95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 5 s、72 ℃ 30 s，共30个循环。每个样重复3次。

1.2.3Western blot检测 处理细胞，进行蛋白提取，定量后十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳、转膜、免疫印记，最后化学显影、定影。结果分析以目标条带IOD值与β-actin IOD值的比作为蛋白质的相对表达水平。每个实验重复3次,取平均值。

1.2.4细胞增殖能力检测 将对数生长期的细胞常规消化、重悬，将细胞悬液接种至96孔板中，在96孔板中分别处理3组细胞，干扰组和对照组均设置 6 个平行孔；24 h后取出其中一块96孔板，小心移除培养基，在待检测的样品中加入5 mg/mL MTT液体,于 4 h 之后终止细胞培养；移除各孔内的上清液，在孔内分别加入二甲基亚砜150 μL,将96孔板置于电动摇床上低速振荡10 min，使结晶充分溶解; 使用酶联免疫法检测波长490 nm 处各孔的光密度(OD)值，实验重复3次，绘制生长曲线。

1.2.5Transwell检测细胞侵袭能力 取对数生长期的A549 细胞培养处理24 h，收集细胞并调整细胞浓度至2×105个/mL；将无血清培养基稀释好的Matrigel胶80 μL 加入到Transwell小室，37 ℃平衡过夜；下室中加入含20% FBS的1640培养基500 μL，上室中加入150 μL制备好的细胞悬液，在37 ℃ 5%CO2孵育24 h后,取出小室,用棉签擦去上室的细胞,4%多聚甲酸固定15 min,PBS洗涤1次,结晶紫染色10 min,PBS洗涤1次;高倍显微镜下选取并计数上、下、左、右、中5个视野,计算穿过小孔的细胞数，取平均数，每组实验重复3次。

2 结 果

2.1荧光定量PCR检测EMX2 mRNA表达 转染后24 h，干扰组、未干扰组及阴性对照组的EMX2 mRNA表达量分别为10.47±0.21、0.75±0.12、1.02±0.09。干扰组A549细胞中EMX2 mRNA表达明显上调(P<0.05)，其余两组EMX2 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2Western blot检测EMX2蛋白表达 干扰组、未干扰组及阴性对照组的EMX2 蛋白表达分别为0.97±0.13、0.24±0.11和0.32±0.09。经过慢病毒转染的A549细胞EMX2的蛋白表达明显上调(F=127.67，P=0.000)，未干扰组和阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 Western blot检测EMX2 蛋白在各组中的表达量

2.3过表达 EMX2对A549细胞增殖的影响 转染24 h，3组细胞OD值差异无统计学意义(F=0.306,P=0.595)。转染后48 h开始,干扰组A549细胞的OD值明显低于未干扰组和阴性对照组(P<0.05)，未干扰组和阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。转染后48 h，干扰组A549细胞的增殖受到明显抑制，其余两组未受到抑制，见图2。转染后24 h,干扰组A549细胞抑制率维持在一个较低水平上，48 h抑制率明显上升达到39.66%，72 h达到新高度52.31%，见图3。

图2 不同时间各组的OD值

图3 干扰组不同时间抑制率

2.4过表达EMX2对A549细胞迁移能力的影响 干扰组、未干扰组及阴性对照组的A549细胞迁移数分别为19.23±3.89、47.24±4.11、43.57±2.09，干扰组细胞侵袭数明显低于阴性对照组和未干扰组(F=68.57，P=0.000)，阴性对照组和未干扰组差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

肺癌是全球广泛存在的最常见的一种癌症，是导致与癌症相关死亡的直接原因[4]。非小细胞肺癌占肺癌病理类型的80%，已经成为威胁人类健康的主要疾病[5]。尽管肺癌治疗方法取得了巨大进步，但其5年生存率仅有16%，在5年内估计有35%～50%的早期非小细胞肺癌患者死亡[6]。而EMX2属于同源盒基因(HOX)，是一种多基因家族的转录调节基因[7]，通过与DNA结合激活或抑制目的基因[8]。在肿瘤的发生、发展中可以通过调节胚胎的发育和分化、细胞增殖和分化发挥重要的作用[9-11]。LI等[12]研究发现,EMX2是一种肿瘤抑制基因,在胃癌肿瘤组织中其蛋白表达明显降低,体内外实验发现上调EMX2表达能够抑制肿瘤细胞的增殖及转移。OKAMOTO等[13]的研究表明,肺腺癌患者EMX2表达下调。EMX2 mRNA低表达与肺腺癌患者总生存率和无复发生存率下降明显相关[14]。ZHANG等[15]发现,过表达EMX2能够明显抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭能力。

本研究采用慢病毒转染技术使EMX2在肺癌 A549 细胞中出现过表达，细胞的增殖和侵袭能力研究结果显示，经过慢病毒转染处理的A549细胞EMX2 mRNA和蛋白表达明显上调，而未干扰组和阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组细胞增殖能力明显下降(P<0.05)，而未干扰组和阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组细胞侵袭数明显低于阴性对照组和未干扰组(P<0.05)，其余两组差异无统计学意义(P>0.05)。说明过表达EMX2能够明显抑制肺癌A549细胞的迁移，减少恶性肿瘤细胞转移，提高生存率，这可能成为治疗非小细胞肺癌的一个新的靶点。但本研究存在一定的局限性，其只在细胞系中得到了验证，体外环境和机体内部生理环境不完全一致，后续研究将在动物体内研究EMX2基因在成瘤实验中的作用，探讨EMX2抑癌的具体机制、分子基础、调控靶点，为将来临床肺癌的诊断、治疗提供依据。