基于EST-SSR荧光标记和毛细管电泳检测技术分析邵武碎铜茶群体遗传多样性与亲缘关系研究

杨 军，孔祥瑞，王让剑，邱丽玲，郑国华，邱陈华

(1.福建省农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心福建分中心/农业部福建茶树及乌龙茶加工科学观测实验站，福建 福州 350012；2.邵武农业农村局，福建 邵武 354000)

邵武碎铜茶又名“观星茶”也叫“神仙茶”，为有性茶树群体种，2009年入选为福建省农业农村厅认定的福建省茶树优异种质资源保护区。其生长于福建省邵武市和平镇海拔1000多米的留仙峰山上，生长环境多为乱石岩缝，制作成绿茶与红茶品质风味独特，取少量茶与古铜钱一起咀嚼2～3 min，能使铜钱软化而破碎得名，被称为世界两大“奇茶”之一[1]。

近些年，EST-SSR分子标记因来自于功能基因，具有多态性高、共显性、重复性好等特点，在资源鉴定与辅助育种中广泛应用[2-5]。茶树种质资源遗传多样性与亲缘关系分析是野生茶树种质初步鉴定的重要手段。近些年，利用分子标记技术分别对云南白莺山茶树种质资源[6]、贵阳花溪古茶树资源[7]、黔南野生茶树种质资源[8]、香竹簧茶树王与野生茶树种质资源[9]、贵州古茶树种质资源[10]进行研究，结果表明云南白莺山茶树种质资源亚群间存在着基因交流；贵阳花溪古茶树资源由乔木型向灌木型进化；黔南野生茶树种质资源遗传差异较大，遗传基础较宽；香竹簧茶树王与野生茶树、栽培型茶树品种之问的遗传关系较远；由于遗传因素和地理位置不同引起贵州古茶树资源的遗传多样性高。本试验对邵武碎铜茶群体进行个体材料的亲缘关系与遗传多样性研究，旨在对邵武茶树种质进行初步鉴定，为茶树育种、杂交亲本选配提供初步依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试的29份邵武碎铜茶来自于福建省邵武市和平镇留仙峰。以40个福建省茶树良种作为对照(表1)，对照样品采自于福建省农业科学院茶叶研究所。采集各个材料一芽二叶鲜叶后用液氮迅速冷冻处理，保存在-70℃冰箱中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 农艺性状调查 农艺性状调查参考陈亮等[11]撰写的《茶树种质资源描述规范和数据标准》。

表1 69份供试材料的名称与来源

1.2.2 基因组DNA的提取 采用改进的CTAB法[12]提取茶树基因组DNA。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行茶树基因组分子量大小检测，用756-MC型紫外分光光度计测定茶树基因组DNA的纯度(OD260/280比值)。

1.2.3 引物合成 参照文献[13]引物序列，序列由上海Sangon公司合成，引物信息见表2。

1.2.4 PCR扩增和产物鉴定 PCR 反应体系为：ddH2O18.8 μL，10×Buffer2.5 μL(Mg2+)，dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL，上、下游primer(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL(0.5 U)，模板DNA 1 μL。PCR反应于美国ABI-9600型扩增仪上进行，热循环程序为：94℃预变性4 min，然后进入下列温度循环：94℃变性45 s，不同温度条件退火60 s，72℃延伸75 s，重复35个热循环；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

引物统一在反向引物(R)的5′段标记荧光(FAM/TAMRA)，由上海百力格生物科技有限公司合成。扩增产物0.5 μL，GeneScanTM500 ROXTM0.5 μL，HiDi 9 μL，混匀后使用ABI公司3730XL进行毛细管电泳。

1.2.5 数据处理 采用ABI公司的GeneMapper 4.0软件，选择GeneScanTM500 ROXTM作为分子量标准，对每一个扩增出的条带记录大小。运用PopGen 3.2软件计算Shannon信息指数(I)和Nei’s基因多样性指数(H)。运用NTSYSpc2.1中的Tree plot程序进行聚类分析。

表2 20对 SSR 引物及其序列

2 结果与分析

2.1 邵武碎铜茶叶片性状初步调查

从表3中看出邵武碎铜茶种质资源，叶身多为平，叶片着生状态为稍上斜与水平，叶面以微隆起为主，叶尖以渐尖为主；调查叶片长宽比值范围在1.92～3.06，平均值为2.40，推测叶片以椭圆形为主，少量为长椭圆形；叶面积平均值为17.87 cm2，为小叶种，与当地种质资源描述为中叶种有所差异，叶面积大小受叶片调查代表性、调查时间与生长环境气候变化相关，推测有性邵武碎铜茶种质资源群体为小叶种与中叶种并存。

2.2 亲缘关系分析

从相似系数聚类图1上看出，69个参试材料分为8个类群，除TY286、TY299、TY264外，其它邵武碎铜茶种质资源分布于类群A、B、C；D类群主要为闽东地区绿茶品种资源；E类群主要为黄棪、金牡丹等高香乌龙茶品种资源；F类群主要为闽北乌龙茶品种资源；G类群主要为闽南乌龙茶品种资源；H类群主要为福云系列绿茶品种资源。从整体上看，邵武碎铜茶种质资源与福建主要茶树品种未聚类在一起，分为3个相对独立的类群。与具有云南遗传基础的福云系列品种资源相比，邵武碎铜茶跟福建省品种资源亲缘关系相对较近，说明本研究的亲缘关系在一定程度上反映了不同群体资源间遗传距离的远近。同时，邵武碎铜茶种质资源具有独特的遗传背景。

表3 叶片性状调查结果

注：农艺性状调查时间为8月。

2.3 群体间遗传多样性比较分析

从表4中看出，A-H群体中Shannon遗传多样性指数最高的为B、C群体，推测在群体数量差不多情况下，邵武碎铜茶种质资源遗传多样性丰富；Shannon遗传多样性指数最低的为E、F群体。Hardy-Weinberg遗传偏离指数D主要反映Ho(观测杂合度)和He(期望杂合度)之间的平衡关系，D值越接近0，基因型的分布就越接近于平衡状态，D值大于0说明存在杂合子过剩，D值小于0，说明存在杂合子缺失现象[14]。类群A、F、G的Ho与对应的He相当，说明这3个类群基因型的分布就越接近于平衡状态；类群B、C、D、E、H 的Ho高于对应的He，D值大于0，杂合子过剩现象，尤其是类群H的D值最大，属于亲本单一，基本遗传背景来自与福云系列；整体邵武碎铜茶种质资源的D值趋向0，说明邵武资源整体基因型的分布趋向平衡，群体相对稳定。

从群体聚类图2看出，同属邵武碎铜茶种质资源的类群A、B、C聚类在一起，群体遗传背景相对一致；类群D、E、F、G聚类在一起，主要为福建审(鉴)定品种；H类群主要为福云系列绿茶品种资源，与其它福建茶树种质资源亲缘关系相对较远，说明其云南种质资源遗传基础起到一定的作用。

图1 遗传相似系数聚类图Fig.1 Dendrogram on genetic similarity

表4 对比11个群体遗传多样性

图 2 群体遗传相似系数聚类图Fig. 2 Dendrogram on genetic similarity of various groups

3 讨论

3.1 遗传多样性分析

茶树种质资源Shannon多样性指数是衡量茶树种质资源遗传多样性的重要指标。91个云南千家寨不同海拔野生茶树Shannon多样性指数为1.33[15]；广东历史名茶群体种曲江罗坑茶与丰顺马图茶Shannon多样性指数分别为1.217与1.228[16]；38个湖南黄金茶Shannon多样性指数为0.55[17]；福建地区茶树资源Shannon多样性指数为1.16[18]；122个云南野生茶树Shannon多样性指数为0.88[19]。本试验计算29个邵武碎铜茶种质资源Shannon多样性指数为1.1298，与前人研究相比，Shannon多样性指数高于湖南黄金茶与122个云南野生茶树，低于广东历史名茶与91个云南千家寨不同海拔野生茶树，初步鉴定说明邵武碎铜茶种质资源的群体遗传多态性高，多样性丰富。

3.2 邵武碎铜茶亲缘关系分析

29个邵武碎铜茶种质资源与参试对照福建审(鉴)定品种与地方品种均未聚类在一起，说明邵武碎铜茶与福建现有育成品种的遗传背景差异较大，拥有相对独立的遗传背景，具有较强的育种潜力。除参试材料TY286、TY299、TY264外，邵武碎铜茶种质资源主要分为3个群体，每个群体的农艺性状、生化成分、适制性茶类等需要进一步鉴定与观察；参试材料整体聚类分析初步看出，人工选育品种多聚类在一起，比如类群E、H，地方品种多聚类在一起，比如类群D、G，同时，绿茶类型多聚类在一起，乌龙茶类型聚类在一起。