苹果组培外植体消毒及培养基优化试验研究

庞 曼 李 娜 张 心 高玉倩 张蒙蒙 张彦坤

（1河北慕旭农业科技有限公司 河北 定州 073006；2河北省林业科学研究院 河北 石家庄 050061；3定州市科学技术局 河北 定州 073006）

苹果属于蔷薇科，苹果属，是世界主要栽植果树品种之一。落叶乔木，叶椭圆形，有锯齿；果实球形，味甜，营养丰富；果肉清脆香甜，能帮助消化。我国苹果的总产量和栽培面积均位居世界第一，但是苹果品质差、单产低、总体生产水平比较落后，导致这种现状的主要因素之一是苹果病毒病的侵害。

目前应用在苹果育苗上的脱毒方法有很多，但是应用比较广泛的主要是茎尖培养、热处理以及抗病毒剂方法。国内在种苗组培快繁、脱毒方面做了很多的研究工作，但只有少量品种进入工厂化生产阶段，尽管组培苗的生产具有繁殖周期短、繁殖系数高、不受生长季节限制、生产种苗质量好、整齐度高、可脱去部分植物病毒等诸多优点，但也存在着一次性投资大、成本高、技术步骤繁杂、技术易传性差、试管苗成活率低、推广难度大等缺点。因而如何降低生产成本，简化工艺，提高繁殖系数和成活率，达到规模化、商品化生产是组培技术研究的重要方向[1]。本试验就组培过程中外植体消毒和培养基的优化以及接种方面进行了研究，为苹果育苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料。幼苗：取自公司大棚内苹果小苗。其他材料：MS培养基、蔗糖、琼脂、6-BA、吲哚丁酸(IBA)、升汞(0.1%)、酒精(95%)等。

1.2 试验方法

1.2.1 预处理。2016年4月中旬，从待脱毒苹果苗上剪取接穗，采用切接法嫁接在盆栽实生砧苗上，嫁接成活后，按常规苗在室外进行管理。经过一年培育后，于第二年在定州市东亭镇国家农业科技园区的智能温室内继续培养，于地面以上15 cm剪截留5个左右饱满芽，待苹果苗萌动长出幼叶后，进行热处理脱毒，具体方法：将其移入恒温热处理箱，在30℃下处理2d后，每天升高1℃，当温度升至36℃时，处理2 d，升至37℃时处理2 d，然后在38℃下恒温处理30 d[2]。

1.2.2 外植体的获取。在热处理过程中长出的新梢顶端切取2～3cm的顶尖作为外植体，在低倍显微镜下剥离幼叶和叶原基，切取0.3～0.5mm的茎尖进行组织培养。

1.2.3 外植体消毒处理。使用75%酒精和0.1%升汞进行消毒，消毒时间分别为酒精10 s、15 s、20 s，升汞8 min、10 min。基础培养基分别为MS+蔗糖30 g/L、2/3MS+蔗糖20 g/L、1/2MS+蔗糖15 g/L、1/3MS+蔗糖10 g/L，其他配比：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+6 g/L琼脂。

1.3 指标计算方法

污染率(%)=(真菌或者细菌污染的芽数/供试芽数)×100%

成活率(%)=(未死亡的芽数/未被污染的芽数)×100%

萌发率(%)=(转绿的芽数/接种数)×100%

褐化率(%)=(产生褐化芽数/接种数)×100%

注：此处的接种数为不含污染的芽数

生长状况描述：茎尖萎蔫、茎尖微黄、茎尖淡绿、茎尖浓绿。

2 结果与分析

2.1 酒精和升汞不同消毒时间对苹果外植体的影响。从表1可以看出，升汞消毒10min时，成活率都不高，污染率为最低48%，但成活率只有30%，说明升汞对外植体的伤害比较大；酒精消毒15s时最为适宜，消毒时间过低表面杀菌不彻底，太高对外植体有伤害作用。综合考虑，酒精消毒15s，升汞消毒8min最适宜。

表1 酒精和升汞不同消毒时间组合对苹果外植体的影响

2.2 不同培养基对苹果外植体诱导影响。从表2中可以看出，2/3MS培养基最有利于苹果外植体的诱导，而且其生长状态也是最好，但总体来说褐化现象还是比较严重。

表2 不同培养基对苹果外植体诱导影响

2.3 接种次数对外植体褐化的影响。从表3可以看出，随着接种次数的增加，外植体褐化率明显下降，考虑成本因素，转接培养基的次数为4时，可达到理想的效果。

表3 接种次数对外植体褐化的影响

3 结论和讨论

在植物离体培养中，外植体消毒是组培的关键技术，常用的外植体消毒试剂比较多，主要有次氯酸钠、过氧化氢、酒精、升汞等，次氯酸钠的灭菌作用很强，易去除，但其碱性很强，对幼嫩植体的毒害作用大，不适宜作灭菌剂。过氧化氢其作用效果最好，对植物外植体的杀害也比较小，但其具有极强的毒性，使用后需回收。酒精对外植体的杀伤力大，作用时间应该严格控制。本试验结果显示，酒精作用时间15 s，升汞作用时间8 s为最适宜的苹果外植体消毒组合。本试验对茎尖不同培养基进行探讨，结果表明，MS培养基中大量元素减去1/3后培养茎尖，褐化率显著低于MS培养基。通过增加培养基转接次数能够明显的降低褐化的程度，可能是增加接种次数使得残留至培养基的代谢物比较少，是否这一原因还需进一步研究。而有研究证明了培养基中的无机盐越低褐化程度越低，因为过高的无机盐能够促进细胞新陈代谢，从而使得细胞内产生的代谢物质增加，遇见氧气后，氧化变褐[3]。

苹果病毒病在全世界各地的分布较为广泛，其危害也很严重，苹果树体受病毒侵害以后，产量会下降，品质也会受到影响，因此经济效益也不高[4]。本试验采用热处理和茎尖组培相结合的方式进行脱毒培养，后期通过酶联免疫结合PCR技术对瓶苗进行病毒检测，结果显示脱毒效果良好，可作为种苗繁殖。