Cider Beer关键酿造工艺的研究

张 箐 ，刘春凤 ，郑飞云 ， 李永仙 ，王金晶 ，李 崎 *

（1.江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

苹果中富含多种酚类物质，包括类黄酮、原花色素[1]和酚酸类物质，可以有效预防癌症、心脏病[2]、糖尿病[3]等心血管疾病，并有抑制人体衰老、抗肿瘤等功效。苹果作为我国第一大果品，大多以鲜食为主，占苹果总量的80%以上[4]；而苹果的深加工主要为苹果浓缩汁加工业，目前也出现严重的产能过剩，苹果二、三级深加工是限制苹果加工产业提高附加值的主要因素[5]。科学研究表明啤酒中约含有17种氨基酸，营养物质丰富，适量饮用啤酒有助于人体健康[6-7]。根据“2015中国啤酒业年度高峰论坛”报告显示，我国啤酒在持续发展的情况下，2014年啤酒行业产量为4 921.9万千升，出现了24年以来的首次负增长，预示着啤酒行业进入发展成熟期[7]。啤酒企业将从产品差异化、产品品质化和产品高端化等方面发力，满足啤酒市场“低酒精、果味型、低浓度、功能型”的发展趋势。

目前，国际上Cider Beer的酿造工艺主要有3种：1）果味型，通过在啤酒中添加香精、柠檬酸等香料制成，其果香非天然发酵型香气；2）勾兑型，把啤酒与苹果汁以不同比例勾兑制成，这种方法制得的产品稳定性差，较难推广；3）发酵型，是以苹果汁为主要原料，通过发酵和调配等方法酿造苹果啤酒，在国际市场上比例逐渐提高。

本研究选取苹果汁为原料，以贫氮条件下具有良好增殖能力和发酵能力的啤酒酵母为发酵菌株，同时结合啤酒酿造工艺研制而成。通过单因素实验确定发酵工艺条件，利用正交实验优化出产品较佳的发酵条件，为进一步大批量工业化生产提供依据。开展此研究，将有助于促进苹果深加工，提高苹果产业附加值，丰富饮料酒市场品类，加强啤酒市场的活跃度，具有很高的实用价值[8]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：10种不同品牌市售不含防腐剂的天然浓缩苹果汁，6种不同品种市售苹果，酒花 （青岛大花），3 株啤酒酵母 （Q-03、D-8、C-05 分别编号为A、B、C）为本实验室保藏。

试剂：果糖、酒石酸钾钠、碘酸钾、氢氧化钠、硫酸铜、甘氨酸、亚铁氰化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾等试剂均购于国药集团（上海）化学试剂有限公司，分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；生化培养箱BSP-250，上海博迅公司；阿贝折光仪，泰光有限公司；Kjeltec TM 8400全自动凯氏定氮仪，FOSS公司；低温水浴槽，上海博迅公司；UV-2000分光光度计，FOSS公司。

1.3 实验方法

1.3.1 制作工艺浓缩苹果汁→稀释→调整pH→添加酒花→灭菌、冷却→接菌发酵→过滤→Cider Beer成品。

1.3.2 苹果汁的制备苹果汁可以通过浓缩苹果汁稀释和苹果榨汁后过滤两种方式获得。

1.3.3 常规指标检测总氮（凯氏定氮法）、α-氨基氮、游离氨基酸和多酚采用ASBC分析方法进行检测[9]。原麦汁质量浓度（密度瓶法）、还原糖（菲林试剂）、乙醇体积分数（密度瓶法）、总酸（电位滴定法）采用国标法进行检测[10]。

1.3.4 苹果汁糖组分检测采用高效液相色谱法（HPLC），具体检测条件为：色谱柱：Xbridge Amide色谱柱 （3.5 μm，4.6 mm × 250 mm i.d.）。 流速 1.0 mL/min；柱温35℃；载气压力350 kPa；漂移管温度50℃；增益 6。

1.3.5 发酵菌株的选择

1）贫氮条件下菌株增殖能力检测。取初始糖度为10%的纯苹果汁制作固体培养基，取5 μL菌液，分别以 1×105个/mL、1×104个/mL、1×103个/mL 菌浓，在培养基上进行菌落涂布培养，并随时间记录平板菌落个数。

2）贫氮条件下菌株发酵能力检测。利用发酵菌株在10%的苹果汁中进行发酵实验，通过CO2失重法记录每天失重量；主酵结束后检测残糖和α-氨基氮的质量浓度，并计算其利用率。

1.3.6 发酵取酵母泥接种于无菌苹果汁中，用灭菌后的发酵栓将瓶口密封，11℃下发酵，每24 h摇瓶一次排出CO2后称重，主酵结束后过滤发酵液，低温保存待测。

1.3.7 单因素实验选用较佳的苹果汁原料和较佳的酵母菌株，在其他条件相同的情况下，采用不同的发酵温度、发酵时间和酵母接种量用“1.3.6”进行发酵实验，以“1.3.9”为标准进行感官品评，逐个考察各发酵条件对感官品评的影响，确定每一因素的最佳水平。

1.3.8 正交实验根据“1.3.7”单因素实验结果，使用发酵时间、发酵温度和酵母接种量3个因素，进行L9（34）正交实验，以感官评价作为评价指标（见表1）。

1.3.9 感官品评该研究组织本校经过感觉品评培训的老师及学生共40位，由品评小组打分（见表1）。

表1 Cider Beer感官评分标准表Table 1 Sensory evaluation criteria of Cider Beer

2.1 苹果汁原料的选择

在酵母增殖和发酵的前期，α-氨基氮是酵母所利用的重要氮源。啤酒酵母对α-氨基氮的质量浓度要求在160 mg/L左右，质量浓度过低会影响酵母的增殖和发酵[11-12]。针对不同来源的苹果汁，检测其还原糖和α-氨基氮质量浓度，结果如表2所示。

从表2可以看出，苹果汁中α-氨基氮远低于普通啤酒酵母对其要求，在相同条件下，浓缩苹果汁的α-氨基氮质量浓度普遍高于鲜榨苹果汁的α-氨基氮质量浓度，这可能与苹果榨汁不彻底、过滤损失有关。刚榨出的苹果汁中，含有大量的多糖、果胶和果皮果肉等固形物，会影响果汁的稳定性、阻碍酒液的澄清并且影响成品酒的风味和口感[13-14]，样品7在α-氨基氮质量浓度上最高，进一步检测其糖组分，检测结果如表3所示。

由表3可知，苹果汁中主要糖为果糖（64%）和葡萄糖 （33%），符合啤酒酵母发酵对糖的需求；另外，从产品工业化生产的角度考虑，以浓缩苹果汁作为原料有利于原料的长久储存和远距离运输。综上，本实验选取样品7为酿制Cider Beer的原料。

表2 浓缩苹果汁成分分析Table 2 Analysis of components in concentrated apple juice

表3 样品7糖组分分析表Table 3 Analysis of carbohydrate components in concentrated apple juice 7

2.2 酵母菌株对Cider Beer发酵的影响

酿酒酵母是影响啤酒品质的重要因素之一，不同的酵母菌株有着不同的生理特性，其代谢副产物的种类及质量浓度不同会造成酒体风味和感官的差别，直接影响啤酒的质量[15]。

2.2.1 贫氮条件下菌株增殖能力检测选取在贫氮条件下生长状况较强的A、B和C菌株，通过固体培养基上涂布菌落计数的方式，对比3种酵母菌株的增殖能力，见表4。可发现，B和C两株菌更适应纯苹果汁的贫氮环境，增殖速度快，且增殖能力强。

2.2.2 贫氮条件下菌株发酵能力检测当发酵温度为11℃，酵母接种量为1×107个/mL，选取A、B和C三株菌，在初始糖度为10%的纯苹果汁中进行发酵实验，记录每天CO2失重情况，主酵结束后对还原糖和α-氨基氮等指标进行检测。具体发酵失重情况如图1所示，对应理化指标检测结果见表5。

表4 不同酵母在苹果汁固体培养基上的涂布生长情况Table 4 Coating growth situation of yeast on solid medium

图1 酵母发酵失重曲线Fig.1 Weight loss situation of yeast fermentation

表5 发酵前后理化指标检测结果Table 5 Index detection results before and after fermentation

通过图1发现，酵母A起酵最慢，在纯苹果汁条件下，不能很快的适应此环境，发酵能力最弱；而酵母C起酵最快，整体发酵能力强于酵母A和B，能够较好的适应纯苹果汁的环境进行增至发酵。通过表5发现，贫氮条件下，在α-氨基氮的利用率以及糖的利用率方面，C的α-氨基氮的利用率为49.52%，而同等情况下A为14.24%，B为15.32%。综合考虑，本实验选取发酵菌株为酵母C。

2.3 单因素实验结果

2.3.1 温度对Cider Beer发酵的影响发酵时间为7 d，酵母接种量为1×107个/mL，发酵温度分别是8、11、14、18℃。在此条件下进行发酵实验，确定发酵温度，结果如图2所示。

图2 发酵温度对Cider Beer的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on cider beer

由图2可见，一定发酵时间内，随着发酵温度的增加，Cider Beer的感官品评的分值先增加后减少。在低温发酵条件下，发酵周期较长，可使得苹果汁中特有的挥发性香味物质生成，并且使酒体口感更协调，但是过低的发酵温度，酵母起酵晚，发酵速率过低，而高温发酵会造成挥发损失，使酒体淡薄[16]。

在发酵过程中，随着温度的升高，Cider Beer中的含糖量先增加后减少，当8℃条件下发酵，酵母起酵晚而造成发酵迟滞；综合以上的因素，选择发酵温度为11℃。

2.3.2 发酵时间对Cider Beer的影响调整发酵温度11℃、酵母接种量为1×107个/mL，发酵时间分别是4、6、8 d和10 d。在此条件下进行发酵实验，并检测其乙醇体积分数、糖度并进行感官品评实验，结果见图3。

发酵时间是影响啤酒外观、口感和风味的重要因素，在一定的发酵时间内，啤酒外观清亮度会随时间增加而提高，香气更协调，风味口感也会更宜人[17]。由图3可见，感官品评得分在0～6 d内逐渐提高，在第6天时达到最大值，之后6～10 d感官品评指标不断下降。在发酵过程中，酵母菌会持续进行代谢将糖分解为酒精，乙醇体积分数会随着发酵时间逐渐升高。综上所述，较适发酵时间为6 d左右。

图3 发酵时间对Cider Beer的影响Fig.3 Effect of fermentation time on cider beer

2.3.3 酵母接种量对Cider Beer的影响酵母接种量是影响啤酒感官品评的重要因素，它会影响啤酒的风味物质形成和乙醇体积分数[18]。本研究在11℃的发酵温度下，发酵时间6d，酵母接种量分别是6×106个/mL、8×106个/mL、10×106个/mL、12×106个/mL和16×106个/mL。在此条件下进行发酵实验，确定较佳酵母接种量的范围，结果如图4所示。

由图4可见，酵母接种量在6×106个/mL～10×106个/mL之间时，感官品评指标随着酵母接种量的增加而提高。当酵母接种量在10×106个/mL～16×106个/mL之间时，感官品评指标随着酵母接种量的增加而减少。由图4还可以看出，在发酵过程中，糖度随着酵母接种量的增加而整体呈现下降的趋势，同时乙醇体积分数整体升高。当接种量在10×106个/mL时，糖度下降量和乙醇体积分数的升高量比较小；综上所述，选择较适接种量为10×106个/mL。

图4 酵母接种量对Cider Beer的影响Fig.4 Effect of yeast inoculation quantity on cider beer

2.4 正交实验结果

2.4.1 正交实验结果与分析根据以上的单因素实验结果，针对发酵温度、发酵时间和酵母菌的接种量3个因素进行正交实验，每个因素3个水平进行L9（34）实验设计，如表 6 所示。

表6 实验的因素水平表Table 6 Factors and levels of experiment

由表7中各因素k和R的大小，对结果进行分析；通过极差R分析判断，各因素对感官指标影响的主次顺序是：发酵温度＞发酵时间＞酵母接种量。并通过感官指标得出较佳条件为A2B3C1，即发酵温度为11℃，发酵时间为7 d，酵母接种量为8×106个/mL。

表 7 L9（34）正交实验结果与分析Table 7 L9（34） orthogonal experiment results and analysis

根据表8进行方差分析，其中C的平均方差小于2倍的误差e的平均方差，为了提高F检验的灵敏度，我们将C的偏差平方和、自由度并入误差e的偏差平方和、自由度。通过F比值与F临界值的对比，A与B为主要因素，而C为次要因素，其中A与B对感官指标有非常显著的影响，并且各因素对感官指标影响的主次顺序是：A>B>C，这与极差分析所得结果一致。

表8 正交实验方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiment

2.4.2 最佳工艺条件验证由正交优化实验得到较佳工艺条件，即发酵温度为11℃，发酵时间为7 d，酵母接种量为8×106个/mL，为了验证工艺条件可靠性，采用该发酵条件进行发酵实验，并将最终产品与市售19种苹果酒进行同时进行感官品评实验，并分别检测其总糖、总酸、游离氨基酸和多酚质量浓度，结果如表9所示。

表9 验证结果与市售产品感官品评和理化指标Table 9 Result of sensory evaluation and index detection of the sample and products

对Cider Beer而言，入口合适的酸味可以让口腔有“被充满”的感觉，从而构成酒体的框架，让酒体更饱满，适宜的甜味让啤酒更利口，恰当范围的糖酸比是保持酒体协调的重要因素。由表9可见，口感品评得分较高的样品（感官品评前9个）的总糖质量浓度在9.5～15 g/L之间，总酸质量浓度在7～10 g/L之间，相应的样品更被消费者喜爱。本产品总糖质量浓度为13.28 g/L，总酸质量浓度为6.5 g/L，乙醇体积分数为2.85%mass，优化后感官品评得分为83.5，感官品评得分在20个样品中排名第2，产品具有适宜的糖酸比，外观为金黄色，口味醇正爽口，有明显的果香味和酒花香气，为消费者较喜欢的产品。本产品发酵度为46.51%，普遍低于其它样品，确保以更低的乙醇体积分数和适宜的总糖来满足国内消费者的口味偏好。

游离氨基酸和多酚是Cider Beer中重要的呈味物质和营养物质，氨基酸可以呈现甜、酸、涩、鲜、苦等味感[18]，一定量的多酚可以增加酒体的平衡感，使酒更丰满。由表9可见，本产品游离氨基酸质量浓度为3.60 g/L，在20个样品中排名第3，多酚质量浓度为1.04 g/L，在20个样品中排名第8，具有丰富的营养。

3 结语

Cider Beer是一种以苹果汁为原料，结合低温啤酒酿造工艺研制的发酵型特种啤酒。本产品最终选取7号样品的浓缩苹果汁为发酵原料，选取酵母C为发酵菌株。通过正交实验证明，发酵温度与发酵时间作为主要因素，对最终发酵产品感官指标具有非常显著的影响，各因素对感官指标影响的主次顺序是：发酵温度>发酵时间>酵母接种量。本产品选取较佳工艺条件是发酵温度为11℃，发酵时间为7 d，酵母接种量为8×106个/mL，所得产品的总糖质量浓度为13.28 g/L，总酸质量浓度为6.5 g/L，乙醇体积分数为2.85%mass，发酵度为46.51%，游离氨基酸质量浓度为3.60 g/L，多酚质量浓度为1.04 g/L；经主酵过滤后所得Cider Beer外观为金黄色，口味醇正爽口，果香味和酒花香气明显，口味独特、营养丰富。