谷氨酰胺转氨酶处理对鸭血豆腐品质的影响

王 斌 陈希玲

(1. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2. 江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡 214122)

鸭血豆腐是以新鲜鸭血为原料，加入水、食盐等配料，经过促凝、蒸煮杀菌、冷却成型等工艺流程制成的一种凝胶态食品。传统鸭血豆腐的生产主要依靠小作坊手工制作，所得产品均一程度不高，卫生安全也得不到保障[2]。目前，市售的鸭血豆腐以冷藏方式为主，仍存在货架期短、起孔、色泽暗等问题。

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，TG)是一种通过催化酰基转移反应加速蛋白质共价交联的酶，具有来源广泛、反应条件温和、对营养成分破坏小等特点。TG能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基与赖氨酸之间的酰基转移反应，形成空间网络结构。通过改善蛋白质的结构与特性赋予产品更好的质构特性，提高食品的凝胶性与可塑性。Li等[3]研究了TG对猪肉和鱼糜混合物质量和凝胶特性的影响，发现0.4% TG不仅可以改善相同肉蛋白之间的交联，还能增强猪肉和鲢鱼蛋白质之间的协同作用，为提高肉制品质量提供思路。

本试验拟研究谷氨酰胺转氨酶反应条件对鸭血豆腐品质的影响，并通过单因素和正交试验优化确定最佳的酶处理方式，为运用谷氨酰胺转氨酶改善鸭血豆腐的加工品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

新鲜鸭血：无锡市锡南路农贸菜场；

谷氨酰胺转氨酶：最适温度40～45 ℃，pH 6.0～7.0，泰兴市东圣食品科技有限公司；

氯化钠、柠檬酸钠、氯化钙、戊二醛、磷酸盐、无水乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

恒温水浴锅：DK-8AXX型，上海森信实验仪器有限公司；

物性分析仪：TA.XT2i型，英国Stab.Micro Systems公司；

高精度分光测色仪：UltraScan Pro1166型，美国Hunterlab公司；

高速落地离心机：Sorvall LYNX6000型，德国Thermo公司；

低场核磁共振分析仪：MesoMR23-060V-I型，苏州纽迈分析仪器股份有限公司；

真空干燥箱：DZF-6020型，上海森信实验仪器有限公司；

扫描电子显微镜：su1510型，日本日立株式会社。

1.2 方法

1.2.1 鸭血豆腐工艺流程

鸭血抗凝→加入盐溶液，调节pH至中性→添加TG→抽气→40 ℃保温→促凝→蒸煮→冷却→贮藏[4]15

1.2.2 操作要点

(1) 鸭血抗凝：选取柠檬酸钠为抗凝剂，每50 mL鲜鸭血中加入1%抗凝剂50 mL后搅拌均匀。

(2) 抽气：将全血置于真空干燥箱中，40 ℃、真空度0.08 MPa抽10 min。

(3) 促凝：选取氯化钙为凝固剂，每15 mL鸭血与抗凝剂的混合液中加入1%的凝固剂1 mL。

(4) 保温：谷氨酰胺转氨酶的最适温度范围是40～45 ℃。王芳等[5]将谷氨酰胺转氨酶于40 ℃条件下保温，探究加酶量等因素对猪血浆蛋白凝胶特性的影响，故本研究选定酶作用温度为40 ℃。

(5) 蒸煮、冷却：90 ℃水浴加热30 min后立刻放入冰水混合物中冷却至室温，然后置于4 ℃下保存过夜。

1.2.3 单因素试验

(1) 酶添加量对鸭血豆腐品质的影响：取40 mL鸭血混合液6份，在保温时间40 min的条件下，按质量比分别添加0.00%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30%的TG，进行质构、色差、持水力、蒸煮损失的测定，比较酶添加量对鸭血豆腐品质的影响。

(2) 保温时间对鸭血豆腐品质的影响：取40 mL鸭血混合液6份，添加0.20% TG，分别在40 ℃下保温0，20，40，60 min，进行质构、色差、持水力、蒸煮损失的测定，比较保温时间对鸭血豆腐品质的影响。

1.2.4 酶处理条件优化 根据单因素试验结果，进一步采用正交试验方案进行优化。以蒸煮损失率为指标，确定酶量和保温时间的最优参数组合。

1.2.5 持水力测定 称取1.000 0 g鸭血豆腐置于2 mL离心管中，于4 ℃、10 000×g离心15 min，取出后先用移液枪吸去上层水分，再用滤纸擦拭表面水分，记录离心管的总质量。按式(1)计算持水力：

(1)

式中：

WHC——持水力，%；

W——空离心管的重量，g；

W1——为离心前离心管+鸭血豆腐的重量，g；

W2——去除离心水分后离心管+鸭血豆腐的重量，g。

1.2.6 蒸煮损失测定 根据文献[6]，修改如下：称取蒸煮前鸭血豆腐的质量记为m1，于自封袋中封口，沸水蒸煮5 min后捞出冷却，蒸煮后鸭血豆腐的质量记为m2，按式(2)计算蒸煮损失率。

(2)

式中：

ω——蒸煮损失率，%；

m1——蒸煮前的质量，g；

m2——蒸煮后的质量，g。

1.2.7 全质构(TPA)测定 将Φ15 mm×8 mm的圆柱体样品放于物性仪载物台，采用TPA模式对样品进行二次压缩。参数设定：探头型号P/35，测前速率2.0 mm/s，测中速度1.0 mm/s，返回速率5.0 mm/s，两次下压之间间隔5 s，压缩比50%，触发力Auto-5 g，每组样品重复测定5次。

1.2.8 红度测定 根据文献[7]，采用标准测色仪测定鱼糜凝胶的亮度L*、红度a*、黄度b*值。

1.2.9 横向弛豫时间(T2)测定及弛豫数据反演 选用CPMG序列测定鸭血豆腐凝胶的横向弛豫时间T2。切取1～2 g块状样品，处理后放入核磁共振仪中25 mm的直径核磁管并进行分析。测试参数设置：质子共振频率为21 MHz，30 ℃下测量。

1.2.10 微观结构分析 根据文献[8]，修改如下：将鸭血豆腐样品切成规格为4 mm×4 mm×4 mm的立方体，在pH 7.2、体积分数2.5%的戊二醛中进行前固定，再用pH 7.2、0.1 mol/L的磷酸缓冲液洗涤3次，每次间隔30 min；然后分别用30%，50%，70%，80%，90%的乙醇进行梯度脱水3次，每次15 min；接着用无水乙醇脱水3次，每次持续15 min。将处理后的样品置于-20 ℃预冷的真空冷冻干燥机中干燥27～28 h，喷金处理后用扫描电子显微镜进行冻干鸭血豆腐的微观结构观察。

1.2.11 数据处理与分析 通过软件SPSS 19.0的单因素方差分析和LSD后特设测试(最小显著差异)对数据进行统计分析，采用Excel、Origin进行图表处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验条件优化

2.1.1 TG添加量对鸭血豆腐品质的影响

(1) 持水力和蒸煮损失：持水性是反映蛋白凝胶稳定性的重要参数[9]。蒸煮损失主要损失的是水，因此持水性较高的样品蒸煮损失率相应较低。由表1可知，0.10%～0.15% TG时，持水性下降，0.20%～0.30% TG时持水性改善最佳。这是因为TG促进蛋白质分子内或分子间的交联形成牢固的凝胶网络结构，截留了大量的水，从而提高了鸭血豆腐持水性。但继续添加TG，持水性变化不大，可能是蛋白质浓度是固定的，TG浓度增加的同时底物浓度并未随之增加，因此无法促进更多的蛋白质发生交联，截留的水分含量也就变化极微。

(2) 全质构：不同添加量的TG能够影响鸭血豆腐的质构特性，其对硬度、弹性、内聚性、回复性的影响不显著；但胶着性却随着酶添加量的增加而显著增加(表2，P<0.05)，在添加量0.25%时达到最高值691.99，较空白组增加了57.40%。胶着性是模拟样品破裂成吞咽状态时所需要的能量，它反映的是分子间结合作用的强弱或者样品在抵抗外界损坏时保留自身完整性的能力，该数值的上升说明TG的存在促进了血浆蛋白之间的交联，赋予鸭血豆腐更好的韧性。因此添加0.25% TG的鸭血豆腐在运输过程中更能经受外界的损坏。

表1 TG添加量对鸭血豆腐持水力和蒸煮损失的影响†

Table 1 Effects of TG dosage on WHC and stewing loss of duck blood tofu %

† *表示与空白组比较，P<0.05。

表2 TG添加量对鸭血豆腐全质构的影响†

† *表示与空白组比较，P<0.05。

(3) 色度：L*和a*对人的感官影响更为密切，应当作为评价鸭血豆腐品质的主要参考指标[4]36。由表3可知，添加TG后红度显著增加，添加量在0.15%以后红度值趋于稳定，因此添加TG能够有效改善鸭血豆腐颜色暗沉的情况。

硬度与样品的保水性等相关，内聚性反映鸭血豆腐的完整性、韧性，是质构测定时的重要参数。TG添加量0.25%时，鸭血豆腐质构特性最好，色泽暗沉的问题也得以改善，该水平下的鸭血豆腐持水力优于空白，因此选择0.25%作为最佳酶处理量。

表3 TG添加量对鸭血豆腐色度的影响†

† *表示与空白组比较，P<0.05。

2.1.2 保温时间对鸭血豆腐品质的影响

(1) 持水力和蒸煮损失：由表4可知，持水性和蒸煮损失率的变化趋势基本保持一致，二者在40 min 前呈上升趋势，继续保温至60 min时反而有所下降，但差异性不显著(P>0.05)。说明保温时间对鸭血豆腐持水力和蒸煮损失率的影响不大。

表4 TG保温时间对鸭血豆腐持水力和蒸煮损失的影响

(2) 全质构：由表5可知，与空白组相比，不同保温时间下的鸭血豆腐在弹性、胶着性、内聚性、回复性4个指标上并无显著差异(P>0.05)，说明在添加相同量谷氨酰胺转氨酶的情况下，保温时间的改变对鸭血豆腐弹性、胶着性、内聚性、回复性的影响不大。但硬度随保温时间延长而增大，40 min时达到最大值(869.70)，40 min 以后又出现回落，可能是保温时间过长导致已经完成交联的蛋白质凝胶劣化，因此硬度有所下降。

(3) 色度：由表6可知，试验组鸭血豆腐的红度均显著高于空白组(P<0.05)。添加0.20% TG于40 ℃保温条件下，红度a*在40 min左右达到最大值(10.22)，此时色泽是最好的。

表5 保温时间对鸭血豆腐全质构的影响†

† *表示与空白组比较，P<0.05。

表6 保温时间对鸭血豆腐色度的影响†

† *表示与空白组比较，P<0.05。

根据硬度和色度的相关指标，保温40 min的鸭血豆腐产品质量优于其他试验组，因此保温时间选择40 min为宜。

2.2 酶处理条件的正交优化

2.2.1 正交优化试验 为进一步优化加酶处理鸭血豆腐的生产工艺，根据单因素试验结果，选择加酶量、保温时间做两因素三水平正交试验(表7)。分析正交处理鸭血后所得产品的蒸煮损失率，从而进一步确定最佳酶处理方式。试验设计及结果见表8。由表8可知，因素影响的主次关系为加酶量>保温时间，最优组合为A2B1，即添加0.25% TG，40 ℃下保温30 min。

2.2.2 最佳组合的验证实验

(1) 弛豫时间与水分分布：低场核磁测试作为一种新型的无损检测方法可以监测食品中的水分状态和移动情况，为提高产品的稳定性提供了有力的保证[10]。由表9可知，不同处理方式的鸭血豆腐凝胶在1～10 000 ms内T2分布出现了4个峰，这4个峰代表了4个组分，T21(<1 ms)、T22(<10 ms)是最难迁移的水，即与大分子紧密结合的水，根据蛋白结合水性质的微弱不同可以分为结构结合水和吸附结合水，T23是滞留于凝胶网络结构中不易移动的水，T24为鸭血凝胶中的自由水。

表7 正交因素水平

表8 正交试验设计与结果

T2弛豫时间是对样品内部氢质子所处化学环境的反映，它与氢质子所受束缚力大小及其自由度有关。当氢质子所受束缚越大或自由度越小，则T2弛豫时间越短，在T2谱上峰出现的位置越靠左；反之T2弛豫时间越长，峰位置则越靠右[11]。试验组鸭血凝胶T23弛豫时间整体较空白组向左迁移，这说明添加TG酶处理后鸭血豆腐内部的水分受到的束缚力增加，其中加入TG酶处理使T23和T24明显降低，这表明不易流动水分子和自由水的移动性显著降低，从而证明谷氨酰胺转氨酶的加入促使水分结合地更紧密。

表9 处理方式对鸭血凝胶弛豫时间的影响†

† *表示与空白组比较，P<0.05。

鸭血凝胶保水性主要取决于不易移动水。鸭血豆腐保水性的变化也正是因为自由水减少、结合水上升所引起的。这可能是交联过程中蛋白质的亲水基团暴露，使自由水转化为不易移动水。如图1所示，0.25%TG+40 ℃ 下保温处理30 min的鸭血豆腐中自由水含量减少，结合水与不易移动水占比增加最为显著。这是因为TG酶增加了蛋白之间的交联，形成致密的网络结构，包合更多的水分，因此鸭血豆腐品质也是最优的。

(2) 全质构测定：由表10可知，第4组(0.25% TG+30 min)鸭血豆腐内聚性和回复性分别为0.90和0.42，均达到最高水平，说明添加0.25% TG，保温30 min促进了蛋白交联，但又不至于过分交联导致鸭血豆腐韧性过大，因此该处理方式下的鸭血豆腐的品质优于其他组。

0. 未添加TG未保温 1. 0.20% TG+30 min 2. 0.20% TG+40 min 3. 0.20% TG+50 min 4. 0.25% TG+30 min 5. 0.25% TG+40 min 6. 0.25% TG+50 min 7. 0.30% TG+30 min 8. 0.30% TG+40 min 9. 0.30% TG+50 min

图1 处理方式对各峰峰面积百分数的影响

† *表示与空白组比较，P<0.05。

(3) 微观结构：较强凝胶强度形成的原因是存在规则的结构。由图2可以观察到天然状态下形成的鸭血凝胶体系是由纤维蛋白形成的错综复杂的网状结构，孔径较大、杂乱无章，水分容易渗漏。这种粗糙、不规则的网状结构会导致不理想的硬度、口感。加入0.25% TG、40 ℃下保温30 min的鸭血凝胶中蛋白质交联、堆积在自身凝胶体系中，形成更均一、紧密的网络结构，该凝胶结构网孔变小，能够有效包合水分，防止鸭血豆腐脱水皱缩[12]，也赋予产品较好的可塑性。

图2 鸭血豆腐的扫描电镜图

Figure 2 Scanning electron micrographs of duck blood curd by different methods (×5 000)

3 结论

利用单因素试验研究了加酶量、保温时间对鸭血豆腐的质构、颜色、持水性等指标的影响，通过两因素三水平正交试验对条件进行优化，确定最佳的酶处理方式为：添加0.25% TG并在40 ℃下保温30 min。利用此优化条件进行实验验证，最终所得鸭血豆腐的持水性提高、胶着性、内聚性等质构特性得到明显改善。食用胶具有改善蛋白热诱导凝胶的特性，后续可进一步探究谷氨酰胺转氨酶与食用胶复配对鸭血豆腐品质的影响。