DDX5 对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及凋亡的影响

陈祝锋 王晓艳

作者单位：710038 西安，中国人民解放军空军军医大学第二附属医院骨科(陈祝锋)；150086 哈尔滨医科大学第二附属 医院风湿免疫科(王晓艳)

有研究证实 Th17 细胞在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者的滑膜炎症中发挥着重要作用[1]。目前发现，DDX5 和 lncRMRP 作为 ROR γt 的新型配体，在诱导 Th17 细胞成熟中发挥重要作 用[2]。DDX5 属于 DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)box 蛋白家族成员，是一类进化高度保守的 ATP 依赖 RNA 解旋酶，参与 RNA 合成、剪切、转运各个方面。新近的研究发现，在多种肿瘤中存在 DDX5 表达上调，通过抑制其表达后可减少肿瘤细胞增殖，诱导凋亡[3-10]，然而 DDX5 在 RA 中的研究暂无报道，因此本研究拟探讨 DDX5 在 RA 滑膜成纤维细胞中的表达及其对细胞增殖的影响。

材料与方法

一、材料

siRNA、转染试剂盒购自广东锐博生物技术有限公司；四季青胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司(11011-8611)；TRIZOL 购自美国 Invitrogen 公司(15596026)；青霉素溶液－链霉素溶液(碧云天公司 C0222)、胰蛋白酶购自碧云天公司(C0201)；DMEM / F12 购自美国 HyClone 公司(AC10447353)；引物由哈尔滨欣科瑞公司合成；反转录试剂盒购自 abm 公司(G492)，SYBR Green PCR 试剂盒购自 abm 公司(MasterMix-S)；Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒购自碧云天公司(C1063)；I型胶原酶购自美国 Sigma 公司(C0130)；CCK8 试剂盒购自 MEC 公司(HY-K0301)。倒置显微镜(蔡司 Primovert Hdcam)； Real-time PCR 仪(Rotor Gene Q2 plex)；PCR 扩增仪(Bio-radPIC-2005)、流式细胞仪(贝克曼 Epics XL-MCL)；细胞孵箱、超净工作台(美国 Thermo公司)；高速低温离心机(贝克曼 GS-15R)；酶标仪(帝肯 Infinite M200 Pro)；培养瓶(美国 Corning 公司，430639)。

二、方法

1. 滑膜成纤维细胞原代培养：取行关节置换术的 RA 患者的滑膜组织，放入含 1% 双抗的 PBS 冰水中清洗 2 次，用解剖剪仔细剔除脂肪组织，然后将组织放入含有 4 mg / ml I 型胶原酶的 DMEM / F12 中，将组织剪成 1 mm3的碎片，然后转移至 15 ml 离心管，37 ℃ 孵育 120 min(每隔 15 min 摇晃几次)，细胞悬液经 70 μm 细胞滤网过滤，离心半径 7.5 cm，1000 r / min，离心 5 min，DMEM / F12 洗涤 2 次，细胞最终悬浮于含 10% 胎牛血清，1% 青霉素链霉素溶液的 DMEM / F12 中，接种到培养瓶中培养。每隔 3～5 天换液 1 次，第 3～6 代细胞用于本实验。

2. RT-qPCR：收取行膝关节置换手术中取下的 RA 患者滑膜组织(8 例)及行关节镜手术的半月板损伤患者的滑膜组织做对照(3 例)，迅速放入液氮中带回实验室。用液氮研磨滑膜组织，Trizol 法提取总 RNA，比色杯测 RNA 浓度，用 2 μl RNA 进行逆转录，逆转录 20 μl 体系：RNA Template 2 μg， AccuRT Reaction Mix(4X)2 μg，Nucleose-free H2O up to a total volume of 8 μl，室温放置 5 min，AccuRT Reaction Stopper(5X)2 μl，5X All-In-One RT MasterMix 4 μl，Nuclease-free H2O 6 μl。逆转录反应条件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15min，85 ℃ 5 min。PCR 反应体系：EvaGreen 2X qPCR MasterMix 5 μl，Forward Primer(10 μM)0.3 μl，Reverse Primer(10 μM)0.3 μl，Template DNA＜＝500 ng / reaction，Nuclease-free H2O to 10 μl，PCR 反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 60 sec，40 cycles。采用 2-△△CT法，设对照组表达为 1，算出 fold change。引物序列：GAPDH，forward：5’-GGAG CGAGATCCCTCCAAAAT-3’，reverse：5’-GGCTGTT GTCATACTTCTCATGG-3’；DDX5，forward：5’-GC ACAGCACAAGAGGTGGAA-3’，reverse：5’-TCCCT GAGCTTGAATAGCAGT-3’。

3. siRNA 转染：用广东锐博生物的转染试剂盒(R0510)，操作按照说明书进行，应用 1× riboFECTTM CP Buffer 稀释 siRNA，混匀加入 3 μl riboFECTTM CP Reagent，制备成转染复合物，室温孵育 10 min，然后将转染复合物加入适量无双抗完全培养基中混匀，将培养版放置 37 ℃ 孵箱培养 24～72 h。

4. CCK8 测定细胞活性：将细胞浓度调整为 1×105/ ml，每孔 100 μl 接种于 96 孔板上，siCtrl 组和 siDDX5 组分别加入不同 siRNA 转染复合物，每组设 6 个重复孔。继续培养 24～72 h，加人 CCK8 10 μl，放置于孵箱内培养 2 h，用酶标仪检测 450 nm处的吸光度值(OD450)。

5. 流式细胞仪测定细胞凋亡：取转染后的两组细胞，将培养液吸出至 15 ml 离心管内，PBS 洗涤 1 次，然后加用 0.25% 胰酶消化 2 min，加入原培养液终止消化，将细胞轻轻吹下，收集至 15 ml 离心管内离心(离心半径 7.5 cm，1000 r / min，离心 5 min)，弃上清，加入 PBS，调整细胞数为 1×l06/ ml，取 1 ml 细胞悬液 1000 r / min 离心 5 min，弃上清，加入 5 μl Annexin V-FITC，10 μl PI，轻轻混匀，室温避光孵育 10 min 后，上流式细胞仪检测。

三、统计学处理

采用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析，设定检验水准 α＝0.05，统计方法应用t检验，P＜0.05 差异有统计学意义。

结 果

一、RA 与正常对照组滑膜中 DDX5 的表达

设正常对照组表达为 1，RA 组滑膜组织中 DDX5 mRNA 的表达为 1.61±0.63，P＜0.05，t＝4.56(图 1)。

二、转染 siDDX5 后，RA 滑膜成纤维细胞增殖情况

CCK8 检测 RA 滑膜成纤维细胞的活性显示，转染 siCtrl 后，24 h，48 h，72 h OD450 分别为 ( 0.71±0.008，0.83±0.02，0.89±0.009)，转染 siDDX5 后，24 h，48 h，72 h OD450 分别为(0.7± 0.02，0.79±0.01，0.81±0.02)，结果显示 72 h 两组差异有统计学意义(P＜0.01，t＝5.5)(图 2)。

图1 RA 与正常对照组滑膜中 DDX5 的表达Fig.1 The expression of DNM1L in synovial tissues of RA and normal control

图2 转染 siDDX5 后，RA 滑膜成纤维细胞增殖情况Fig.2 The expression of DNM1L in synovial tissues of RA and normal control

三、转染 siDDX5 后，RA 滑膜成纤维细胞凋亡情况

Annexin V-FITC 检测 RA 滑膜成纤维细胞凋亡显示，转染 siCtrl 72 h 后，凋亡细胞比率为(13.4± 1.44)%，转染 siDDX5 72 h 后，凋亡细胞比率为(21.7±2.12)，P＜0.05，t＝5.35(图 3)。

讨 论

RA 主要病理改变为滑膜炎，滑膜组织增生，滑膜细胞包括滑膜成纤维细胞和滑膜巨噬细胞，滑膜成纤维细胞在滑膜细胞增殖、迁移以及促炎症反应中发挥重要作用[11]。众所周知，Th17 细胞在 RA 发病中发挥重要作用，通过阻断 Th17 细胞的作用有望达到治疗疾病的目的。在诱导 Th17 细胞成熟的过程中，ROR-γt 扮演了重要作用。ROR-γt 的两个配偶体：DDX5 和 lncRMRP 的共同协作，控制了 Th17 细胞的成熟，DDX5 可以促进 RMRP 改变形状并且吸附至 ROR-γt 上，从而形成一种复合体吸附到靶点位置上促进基因的开启。研究发现，当这种机制不存在时，患自身免疫疾病的小鼠模型(EAE)疾病减轻[2]。

DDX5 在多种肿瘤中高表达。Xue 等[3]的研究发现在肝癌组织中 DDX5 表达增高，抑制其表达后肝癌细胞增殖迁移降低，凋亡增加。有研究表明，DDX5 通过 mTOR 信号通路促进胃癌细胞增殖[10]。此外，DDX5 通过 beta-catenin 信号通路促进非小细胞肺癌增殖[5]。乳腺癌中，DDX5 高表达，通过增加促癌表达加重疾病进展[4]。也有研究发现，应用白藜芦醇(resveratrol)后，可通过减少 DDX5 产生，诱导前列腺癌细胞凋亡[8]。同时，DDX5 在食管癌中表达增高，阻断 DDX5 表达后可抑制食管癌细胞增殖和迁移[6]。此外，最近研究发现 DDX5 可通过减少病毒正链 RNA 的负链合成来增强丙型肝炎病毒(HCV)病毒复制[12]。最近报道指出，DDX5 以 stat3 依赖性方式增强结直肠癌细胞增殖和侵袭[9]。可见，在肿瘤中，DDX5 可作为有效的治疗靶点缓解多种肿瘤疾病的进展，然而关于其在自身免疫性疾病中的作用仍未可知。

图3 转染 siDDX5 后，RA 滑膜成纤维细胞凋亡情况Fig.3 Cell apoptosis after the transfection of siDDX5

本研究结果显示与肿瘤一样，RA 滑膜组织同样存在 DDX5 表达增多现象，为进一步研究 DDX5 对 RA 滑膜成纤维细胞的影响，本研究应用小干扰 RNA 转染滑膜成纤维细胞，并进一步检测其对细胞增殖、凋亡的影响。结果显示沉默 DDX5 表达后，RA 滑膜成纤维细胞增殖减低，且凋亡增加。提示 DDX5 可能参与了 RA 滑膜炎的发生发展，通过抑制 DDX5 的表达，有望达到治疗 RA 的目的。然而关于 DDX5 对 RA 局部炎症因子及信号通路的影响以及对关节炎模型疾病的影响，有待进一步研究。

综上所述，本研究首次证实，通过阻断 RA 滑膜局部 DDX5 的表达，有望达到治疗 RA 的目的。