郑州市山羊隐孢子虫感染情况调查与分析

刘复生

(中牟县动物疫病预防控制中心，河南 中牟 451450)

山羊隐孢子虫病是由隐孢子虫(Cryptosporidium)感染山羊所引起的一种肠道腹泻性寄生虫病，可导致患畜出现腹泻、消瘦、食欲不振等临床症状，患畜往往因隐孢子虫的感染而继发其他疾病，严重的可导致死亡，给养殖户造成较大的经济损失[1-2]。隐孢子虫于1907年首次在小鼠体内被发现并命名，至今已发现的隐孢子虫有27个种，超过70个基因型，可寄生于哺乳动物(包括人类)、鸟类等多种动物肠道内，引起严重的寄生虫病[3-4]。隐孢子虫病的传播有多种途径，它可以通过食物、饮水、空气进行传播，宿主因摄入含有隐孢子虫虫卵的粪便、水或食物而感染该病，隐孢子虫病一旦在养殖场中发生，便难以根除。因此，隐孢子虫病的流行给相关养殖业的发展和消费者的健康造成了巨大威胁[5]。

可感染山羊或绵羊的隐孢子虫种类较多，且部分虫种可感染人类，如微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、猪隐孢子虫(Cryptosporidiumsuis)等[6-7]。宋军科等[8]对陕西黑山羊隐孢子虫病的相关调查结果显示，该地区山羊隐孢子虫感染率为14.0%，且虫种为肖氏隐孢子虫(Cryptosporidiumxiaoi)和牛隐孢子虫(Cryptosporidiumbovis)；PENG等[9]对河南和陕西的山羊进行隐孢子虫感染调查，结果显示，山羊隐孢子虫检出率为16.5%，为微小隐孢子虫感染，会对人畜健康造成威胁。因此，对山羊隐孢子虫病进行流行学调查和基因型分析，能够有效防控山羊隐孢子虫病并保障居民的公共健康。本研究对郑州市不同县市山羊隐孢子虫病流行情况进行调查，并对获得的隐孢子虫分离株核糖体18S rRNA基因序列进行扩增与分析，确定其基因型和种系发育关系，为郑州市山羊隐孢子虫病的防控提供依据。

1 材料和方法

1.1 样品采集

于2017年3—11月从郑州市不同县市的山羊养殖场采集山羊粪便样品276份(包括中牟县84份、新密市93份、荥阳市99份)，其中0～6月龄、6～12月龄和12月龄以上山羊粪便样品数量分别为62份、94份和120份。每份粪便样品50～100 g，分别置于封口袋中，标记后于4 ℃保存。

1.2 主要试剂与仪器

TaqMix和DNA提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，PCR仪购自北京六一仪器厂，凝胶成像系统和电泳仪等购自上海天能科技有限公司，不同规格移液器购自赛默飞科技有限公司，引物合成和基因序列测定由上海生工生物工程科技公司完成。

1.3 山羊隐孢子虫的卵囊检测

取被检粪便样品(约30 g)置于盛有100 mL蒸馏水的烧杯中，充分搅拌混匀，经孔径为0.15 mm铜筛过滤，将滤液以3 000 r/min离心5 min，弃掉上清，取适量饱和蔗糖溶液与沉淀充分混匀，并以2 500 r/min离心20 min，用自制铁环蘸取液面进行制片，于400倍显微镜下检测，并参考文献[10]对隐孢子虫形态进行确定。

1.4 山羊隐孢子虫的分子鉴定

设计并合成扩增隐孢子虫核糖体18S rRNA基因序列的引物(18S-F、18S-R)，PCR扩增隐孢子虫分离株核糖体18S rRNA基因序列，目的基因大小为800 bp左右。PCR体系(50 μL)：2×PCR Mix 25.0 μL，无RNA酶水19.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，模板DNA 2.0 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后取6.0 μL的PCR产物进行凝胶电泳检测，将所得阳性样品送至测序公司进行双向测序。

1.5 系统进化分析

应用ClustalX 1.8软件对获得的序列进行拼接，同时于GenBank下载隐孢子虫分离株18S rRNA基因序列，应用DNAstar软件对本研究获得及下载的序列分析同源性和虫株的遗传变异情况。此外，应用MEGA 7.0构建NJ系统发育树(Bootstrap=1 000)。

2 结果与分析

2.1 郑州市山羊隐孢子虫感染情况分析

如表1所示，郑州市山羊隐孢子虫病的感染率为3.26%(9/276)；不同县市山羊隐孢子虫病阳性率存在一定差异，其中以中牟县最低，为1.12%(1/84)，而新密市和荥阳市隐孢子虫病阳性率稍高，分别为4.30%(4/93)和4.04%(4/99)。其中，散养场隐孢子虫病阳性率为3.61%(7/194)，规模化养殖场为2.43%(2/82)。

表1 郑州市山羊隐孢子虫感染情况Tab.1 Prevalence of Cryptosporidium infection in goats from different region in Zhengzhou city

2.2 不同月龄山羊隐孢子虫感染情况分析

如表2所示，不同月龄山羊隐孢子虫病流行情况存在一定差异，其中12月龄以上山羊隐孢子虫病阳性率(1.67%)最低；6～12月龄山羊隐孢子虫病阳性率稍高，为2.13%；6月龄以下山羊感染情况最为严重，其隐孢子虫病阳性率为8.06%。

表2 不同月龄山羊隐孢子虫感染情况Tab.2 Prevalence of Cryptosporidium infection in goats of different month of age

2.3 山羊隐孢子虫分离株核糖体18S rRNA基因序列扩增分析

对9份山羊隐孢子虫分离株核糖体18S rRNA基因序列进行扩增，如图1所示，9份样品均扩增出大小约800 bp的片段，无非特异性条带，且目的片段大小与预期相符。

M：DL2000 DNA Marker；1：阴性样品；2—10：9份山羊隐孢子虫病阳性样品

2.4 山羊隐孢子虫分离株核糖体18S rRNA基因测序与分析

将9份阳性样品PCR产物委托测序公司进行测序后，去掉两端不准确的碱基序列。结果显示，获得的9个隐孢子虫分离株核糖体18S rRNA基因序列大小为821～824 bp，主要大小差异体现在碱基缺失或插入，序列中A+T碱基含量为62.9%～63.1%。同源性分析结果如图2所示，得到的9个

图2 山羊隐孢子虫分离株18S rRNA基因序列同源性对比结果Fig.2 Sequence homologies of 18S rRNA gene of Cryptosporidium isolated from goats

隐孢子虫分离株18S rRNA基因序列(XM-1、XM-2、XM-3、XM-4、XY-1、XY-2、XY-3、XY-4、ZM-1)同源性为97.4%～99.9%，与GenBank中收录的牛隐孢子虫(Cryptosporidiumbovis)(KT922231.1和KT922232.1)的同源性超过98.8%，与其他隐孢子虫分离株同源性较低。

2.5 山羊隐孢子虫分离株18S rRNA基因系统进化分析

使用MEGA 7.0构建NJ系统发育树，结果如图3所示，获得的9个隐孢子虫分离株位于同一分支；与其他隐孢子虫分离株所属分支相比，9个隐孢子虫分离株所属分支与已知牛隐孢子虫分离株(KT922231.1和KT922232.1)聚为一个大分支。

图3 基于18S rRNA基因序列构建的山羊隐孢子虫分离株系统发育树 Fig.3 Phylogenetic tree based on 18S rRNA gene of Cryptosporidium isolated from goats

3 结论与讨论

隐孢子虫是重要的人畜共患性寄生虫之一，开展关于隐孢子虫的流行病学调查和虫种鉴定研究对隐孢子虫病的防控有积极意义，同时有利于保障公共健康卫生。因此，本研究对郑州市不同县市收集的276份山羊粪便样品进行隐孢子虫感染情况调查，结果显示，郑州市山羊隐孢子虫病的平均感染率为3.26%，被调查的中牟县、新密市和荥阳市3个县市均出现隐孢子虫病阳性山羊。此外，郑州市部分县市山羊隐孢子虫病流行情况较河南安阳(0.34%)[11]和安徽及周边县市(0.90%)[12]严重，但没有四川省宜宾(9.90%)[13]严重，提示山羊隐孢子虫病流行情况可能具有地理差异性。此外，大量研究表明，山羊隐孢子虫感染情况差异与宿主发育阶段有关，王永立等[14]对河南省绵羊隐孢子虫流行情况调查，结果发现，与其他发育阶段羊群相比，3周龄内羊群隐孢子虫病感染情况更为严重。陈静等[15]对重庆市部分地区山羊隐孢子虫病调查结果显示，2～3月龄和产后1月龄羔羊的山羊隐孢子虫病阳性率比其他发育阶段山羊高。本研究调查结果与前者类似，6月龄以下山羊隐孢子虫病阳性率(8.06%)高于6～12月龄和12月龄以上山羊(2.13%和1.67%)，调查结果提示幼龄山羊更易感染隐孢子虫病，应为重点防控对象。

对获得的9个山羊隐孢子虫分离株核糖体18S rRNA基因序列进行扩增，结果表明，本研究获得的9个隐孢子虫分离株18S rRNA基因序列大小为821～824 bp，其种内核苷酸同源性为97.4%～99.9%，与已知牛隐孢子虫分离株(KT922231.1和KT922232.1)的同源性最高，高于98.8%，且进化分析结果也显示,本研究所获得的山羊隐孢子虫分离株为牛隐孢子虫。