转录因子Hey1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

吕豆，郗彦凤，李灵敏，步鹏，乔爱琪，郑文亮，郭艳琳*

（1山西医科大学病理学教研室，太原 030001；2山西省肿瘤医院病理科，太原 030013）

肺癌是全球总人口中发病率和致死率均占首位的恶性肿瘤，严重威胁人类的生命健康。在肺癌患者中，约85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），主要包括鳞癌和腺癌。近年来除传统手术治疗和放化疗外，肺癌的靶向治疗、免疫治疗飞速发展，但NSCLC的5年生存率仅为18.6%，晚期NSCLC的5年生存率不足5%，仍有约60%的NSCLC患者治疗手段有限，生存预后差[1]。深入研究肺癌发生进展机制仍尤为重要。转录因子是一类能与特定DNA序列结合，调控靶基因以特定强度、时间、空间去表达的蛋白质分子，其功能异常是导致恶性肿瘤发生的重要病理基础。研究发现通过改变转录因子对肿瘤细胞重编程可以使恶性瘤细胞逆转成多能干细胞[2]，某些转录因子还是肿瘤治疗过程中的重要药物靶点。Hey1基因是碱性-螺旋-环-螺旋（basic-helix-loop-helix, bHLH）转录因子超家族HES/HEY家族成员，在细胞生长、增殖、分化、凋亡过程中发挥重要作用[3]。Hey1还是与肿瘤发生密切相关的 Notch[4]、TGF-β/BMP[5]、Smad[6]等多个信号通路的共同靶点。有研究表明Hey1的异常表达在多种肿瘤发生、进展、转移和预后过程中发挥重要作用[7-12]。肺癌动物模型[13]和肺癌细胞系[14]的研究也发现Hey1存在异常表达，但Hey1基因在人肺癌组织中的表达状况，及其与各临床病理特征之间关系的研究尚未见报道。研究发现，作为Hey1最重要的激活通路之一，Notch信号通路的异常与肺癌的发生密切相关，特别是Notch1的异常表达[15]。以往有关Notch1在非小细胞肺癌表达情况的研究较多，但结果并不完全一致[16-18]。因此，本研究除进一步明确Notch1在NSCLC中的表达情况及意义外，着重研究Hey1在NSCLC中的表达情况，及其与Notch1的表达、各临床病理特征之间的关系，为NSCLC的诊断、药物靶向设计和预后判断提供理论依据。

资料与方法

1 病例资料

收集山西省肿瘤医院病理科2013年6月至2014年6月手术切除术前均未行放疗或化疗的肺癌病例，从中选出临床资料完整和石蜡组织保存完好的病例共246例，其中，鳞癌118例，腺癌128例。男性176例，女性70例，年龄33岁-79岁，中位年龄62岁。TNM分期采用2018年第八版TNM分期标准，Ⅰ期85例，Ⅱ期65例，Ⅲ期73例，Ⅳ期23例。随访截止2018年9月底。另取同期手术的117例癌旁正常肺组织作为对照。所用标本均通过山西省肿瘤医院伦理委员会审批（伦理编号：201845）。

2 制备组织芯片

采用芯片模具制作空白组织芯片。首先根据HE染色切片确定典型病变部位，而后用Marker笔在组织切片和相应石蜡组织块上标记。用金属空心管从已经定位的目标石蜡组织块上钻取组织，并转移至空白组织芯片相应位置。完成后，将做好的芯片置于60℃烤箱中烤10min、取出置室温晾10min，同样的步骤循环8h，使得钻取组织和空白组织芯片融合。连续切片后，将切下的4μm芯片组织裱于经防脱处理的载玻片上，置于67℃烤片机上烘烤50min后备用。

3 免疫组织化学染色

兔抗人Notch1单克隆抗体（ab52627）和兔抗人Hey1多克隆抗体（ab22614）购自Abcam。实验采用En Vision两步法，分别用公司说明的阳性对照作为阳性对照，以0.01mol/L PBS（pH7.4）代替一抗作为阴性对照。将事先制备好的组织芯片切片放入罗氏Bench Mark XT半自动免疫组化染色仪，加一抗（Notch1 1∶100稀释，Hey1 1∶150稀释），苏木精复染、固定、封固、观察。

4 结果判读

每例标本随机选取5个以上的高倍视野，选取具有代表性的区域。Notch1蛋白着色定位于细胞膜和细胞浆，Hey1蛋白着色定位于细胞核。按细胞着色程度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞所占比例评分：＜5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，≥75%为4分。然后将两项得分相加，根据所得总分判断结果：＞2为阳性[19]。

5 统计学分析

应用SPSS 21.0进行统计分析。Notch1、Hey1蛋白阳性表达率采用百分率表示，组间比较采用卡方检验；相关性分析采用Spearman相关；生存分析采用Kaplan-Meier法估计各组患者累计存活率，并用log-rank检验进行统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 NSCLC组织与癌旁正常肺组织中Notch1和Hey1的表达

Notch1在肺鳞癌、肺腺癌和癌旁正常肺组织的阳性率分别为78.8%，28.9%和30.8%，其中鳞癌与腺癌、癌旁正常肺组织间的差异有统计学意义，Hey1在肺鳞癌、肺腺癌和癌旁正常肺组织中的阳性率分别为79.7%，23.4%和33.3%，其中鳞癌与腺癌、癌旁正常肺组织间的差异有统计学意义；肺腺癌组织中Notch1和Hey1阳性率略低于癌旁正常肺组织，差异无统计学意义（图1）。

图 1 Notch1和Hey1在癌旁正常肺组织、肺鳞癌和肺腺癌中的表达。A，Notch1和Hey1表达的 EnVision法免疫组织化学检测（比例尺，100µm）；B，Notch1和Hey1阳性率差异统计学分析；*，肺鳞癌vs癌旁正常肺组织，P＜0.01；**，肺鳞癌vs肺腺癌，P＜0.01；Control，癌旁正常肺组织；SCC，肺鳞癌；AD，肺腺癌Fig. 1 Expression of Notch1 and Hey1 in adjacent normal lung tissues, lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. A, Expression of Notch1 and Hey1 detected by EnVision method of immunohistochemical staining, scale bar 100µm; B, difference statistics analysis of positive rates of Notch1 and Hey1∶ *, lung squamous cell carcinoma vs normal adjacent lung tissue, P＜0.01; **∶ lung squamous cell carcinoma vs lung adenocarcinoma,P＜0.01; Control, adjacent normal lung tissue; SCC, lung squamous cell carcinoma; AD, lung adenocarcinoma

2 NSCLC组织中Notch1和Hey1表达与各临床病理特征的关系

卡方检验显示，肺鳞癌患者Notch1阳性表达与TNM分期和淋巴结转移情况呈正相关，与性别、年龄、吸烟情况、原发肿瘤最大直径、原发肿瘤部位及肿瘤分化程度无关；肺鳞癌患者Hey1阳性表达与TNM分期呈正相关，与肿瘤分化程度呈负相关，与性别、年龄、吸烟情况、原发肿瘤最大直径、原发肿瘤部位及淋巴结转移无关；肺腺癌患者Notch1和Hey1阳性表达与各临床病理特征之间均无关（表1和表2）。

3 SCLC中Notch1与Hey1的表达相关性

肺鳞癌组织中Notch1表达与Hey1表达具有显著的正相关关系（r=0.253，P＜0.01），肺腺癌组织中Notch1表达与Hey1表达具有显著的正相关关系（r=0.176，P＜0.05）（表3）。

4 Notch1和Hey1表达情况与肺鳞癌和肺腺癌患者生存期的关系

在246例非小细胞肺癌患者随访中，截止2018年9月底有222例患者具有完整的随访资料，其中死亡病例88例，至今生存病例134例。肺鳞癌患者Notch1和Hey1表达阴性组生存期高于阳性组，但差异无统计学意义（分别P=0.116，P=0.102）；肺腺癌患者Notch1表达阴性组生存期高于阳性组，但差异无统计学意义（P=0.100）；肺腺癌患者Hey1表达阳性组生存期与阴性组相近，差异无统计学意义（P=0.492）（图2）。

表 1 肺鳞癌中Notch1和Hey1的表达及其与临床病理特征间关系Tab. 1 Expression of Notch1 and Hey1 in lung squamous cell carcinoma and their relationship with clinicopathological factors

讨 论

大量研究表明Notch信号通路异常与肺癌的发生发展密切相关[15]。Notch信号通路包括4个受体（Notch1-4）和5个配体（Jagged1，Jagged2，Delta-like1，Delta-like3和 Delta-like4）。 受 配 体Jagged/Delta激活，Notch受体经两次切割，释放出Notch细胞内结构域（Notch intracellular domain，NICD），NICD转移到细胞核内，启动下游靶基因的转录。以往有关Notch信号通路在肺癌发生进展中作用的研究多集中于Notch1，结果显示Notch1在肺鳞癌中高表达[16,17]，但在腺癌中的表达状况存在分歧[16-18]。本实验结果显示：肺鳞癌组织中Notch1阳性表达率显著高于癌旁正常肺组织，提示Notch1可能促进肺鳞癌的发生，与以往研究结果一致[16,17]；肺腺癌组织中Notch1阳性表达率低于癌旁正常肺组织，但不具有统计学意义。至于肺腺癌中Notch1表达结果的不一致，可能与实验所采用的样本种类（石蜡组织标本、细胞系）、检测方法（免疫组织化学、Western blot）、统计学方法（Spearman相关分析、卡方检验、秩和检验）等不同有关[16-18]。Hey1基因，作为Notch信号通路的直接靶标和效应子，编码一个小的bHLH转录因子，主要通过直接结合核心启动子或抑制其他转录激活因子来抑制靶基因的表达[20]。2012年Heisig等[21]通过GO分析发现：Hey1调节的基因有507个，与凋亡、RNA剪切定位、转录调控、染色质组装、细胞周期的调节、细胞内蛋白的转运有关。研究表明，Hey1在骨肉瘤、结直肠癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌等恶性肿瘤中高表达[7-12]。Konishi 等[14]用实时定量PCR方法发现9个肺癌细胞系Hey1高表达。本实验结果显示：肺鳞癌组织中Hey1阳性表达率显著高于癌旁正常肺组织，提示Hey1的高表达可能参与肺鳞癌的发生。肺腺癌组织中Hey1阳性表达率低于癌旁正常肺组织，但不具有统计学意义。

表 2 肺腺癌中Notch1和Hey1的表达及其与临床病理特征间关系Tab. 2 Expression of Notch1 and Hey1 in lung adenocarcinoma and their relationship with clinicopathological factors

表 3 Notch1和Hey1在肺鳞癌与肺腺癌中表达的相关性分析Tab. 3 Correlation between Notch1 and Hey1 expression in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma

图 2 Notch1和Hey1表达与非小细胞肺癌预后关系的Kaplan-Meier生存曲线分析Fig. 2 Kaplan-Meier survival curve analysis for the relationship of Notch1 and Hey1 expression with the prognosis of non-small cell lung cancer

我们对不同NSCLC病理组织学类型Nocth1和Hey1表达率分别做了组间比较，发现在肺鳞癌和肺腺癌Notch1和Hey1表达情况明显不同，甚至有完全相反的趋势，二者在肺鳞癌表达均增高，而在肺腺癌组织中阳性表达率虽低于癌旁正常肺组织，但不具有统计学意义。出现这个结果的原因，推测可能与以下几个因素有关：①肺鳞癌与肺腺癌虽然同属于NSCLC，但起源于不同的肺部上皮细胞，具有不同的基因表达谱及生物学标志物[22]；②调控肺鳞癌与肺腺癌的细胞微环境和细胞信号通路不同；③肺癌病理组织学类型不同，其发生、发展也不同；④病例数太少等。

研究证实，Notch1高表达与NSCLC淋巴结转移和TNM分期显著相关[16,17]。Hey1在多种实体瘤发生进展过程中发挥重要作用：促进骨肉瘤的侵袭和肺转移[7]；与乳头状甲状腺癌组织病理学分级、甲状腺外侵，复发或软组织转移显著相关[10]；与原发性胶质母细胞瘤肿瘤分级相关[11]；在肝细胞癌中与病理分期正相关[12]。鉴于Nocth1和Hey1在肺鳞癌中的高表达，而在肺腺癌中的表达无统计学意义，我们分别分析了二者与各临床病理特征之间的关系。结果发现，肺腺癌中Notch1和Hey1的表达与各临床病理特征无明显相关；肺鳞癌中Notch1的表达与TNM分期和淋巴结转移呈正相关，提示检测Notch1可作为判断肺鳞癌恶性程度、侵袭和转移的指标，与以往研究一致。Hey1的表达与TNM分期和肿瘤分化程度TNM分期和淋巴结转移显著相关，通常肿瘤的分化程度越低，其恶性程度越高，提示Hey1或许可以作为判断肺鳞癌病理分级和恶性程度的辅助指标，指导临床治疗方案的选择。

本研究Spearman相关分析显示，肺鳞癌和肺腺癌中Hey1表达与Notch1表达呈正相关。现有研究表明，与肿瘤发生相关的调节Hey1的信号通路有Notch、TGF-β/BMP[5]、EGF-b/Smad[6]等，各通路间交叉、共同作用发挥生物学作用，提示Hey1在NSCLC中的表达虽受多条信号通路交叉作用，但可能至少部分是由Notch1来激活的。有关Notch1信号通路还有许多未评估的因子，NSCLC中Notch1信号通路的机制尚不清楚，需要进一步的研究。

有研究通过生存分析显示，NSCLC中Notch1阴性组患者生存期明显高于阳性组[23]，但也有研究表明在肺腺癌中Notch1高表达预后好，而在肺鳞癌中没有意义[24]。Hey1表达与胰腺癌的总生存率降低显著相关[9]。本研究Kaplan-Meier生存曲线显示，Notch1和Hey1表达与NSCLC患者的生存期均无明显相关性。考虑到本研究随访的时间有限，而且存在样本数量偏少的问题，统计结果可能存在一定的偏倚。因此我们下一步将增加临床样本和随访时间做进一步的研究。

综上所述，Hey1和Notch1在NSCLC中存在差异性表达，在肺鳞癌组织中高表达，表明Hey1和Notch1是肺鳞癌发生、发展的重要参与因子，与肺鳞癌的恶性程度密切相关。Hey1在NSCLC中的表达可能至少部分是由Notch1来激活的。