组织固定液选择的实验综述

吴敏 胡天寒

【摘 要】组织的固定是组织病理学中最基本的实验技术方法和技术手段，固定液的正确选择对组织切片的制作、大体标本的保存以及免疫组织化学的检测等都有重要的意义，实验室里错误选择组织固定液的情况屡见不鲜，本文从组织固定的目的入手对常见固定液的分类和选择做一个简单的探讨以期对科研实验人员有所提醒和帮助。

【关键词】组织;组织固定;固定液

中图分类号： R361.2 文献标识码： A文章编号： 2095-2457（2019）03-0136-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.03.057

An experimental review on the selection of tissue fixative solution

WU Min1 HU Tian-han2

（1.Department of Histology and Embryology， Wannan medical college， Wuhu Anhui 241002，China;

2. Experimental Training Center for Medical Information，Wannan medical college， Wuhu Anhui 241002，China）

【Abstract】Tissue fixation is the most basic experimental technique in histopathology.   The correct selection of fixative is of great significance to the production of tissue section， the preservation of gross specimens and the detection of immunohistochemistry. The misselection of tissue fixatives in laboratories is common. This paper makes a simple discussion on the classification and selection of common fixatives and hope to give some reminders and help to researchers and experimenters.

【Key words】Tissue; Tissue fixation; Fixative solution

組织的固定是组织病理学[1-4]及其它科学实验[5-6]中最基本的实验技术方法和技术手段，无论是组织切片的制作还是大体标本的保存，为保持其生前的状态与结构，均应在取材后进行及时有效的固定才能进行后续的实验工作。

1 组织固定的目的

知其然必须先知其所以然，不了解组织固定的目的就谈不上正确地选择组织固定液，很多老师和同学自以为已经了解了固定的目的，但实际常常是一知半解，组织固定的目的主要有：

（1）迅速阻止组织、细胞的自溶和腐败;

（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分凝固成不溶性的物质，保持其生前的状态;

（3）使组织内的各种成分产生不同的折光率，方便染色后的观察与鉴别;

（4）使各种组织成分对不同的染料产生不同的亲和力，使细胞各部易染;

（5）使组织硬化成组织快，方便制备组织切片;

（6）防止细胞过分收缩或膨胀，保持其原有的形态结构。

2 组织固定液的分类及选择

常见的组织固定液分为两大类，由单一试剂组成的为单纯固定液，由两种或以上混合试剂组成的为混合固定液。

2.1 单纯固定液

甲醛是最常使用的单纯固定液之一，饱和的甲醛水溶液浓度为37-40%，用作固定液时的甲醛水溶液称为福尔马林，其甲醛浓度为4%，为一份饱和甲醛水溶液与九份水混合而成，甲醛水溶液的渗透力强，不易使组织收缩，适合大块组织的固定，经福尔马林固定的组织细胞核染色较好，但细胞质染色较差。若要对长期使用福尔马林溶液固定的组织块进行染色须经过24-48小时的流水冲洗。甲醛水溶液久置会产生甲酸，严重时会影响细胞核的嗜碱性染色，可以在配置福尔马林固定液时用自来水代替蒸馏水中和，也可以在甲醛水溶液中投入碳酸镁、碳酸钙等碱性物质中和，如普通的粉笔主要成分为碳酸钙（石灰石）和硫酸钙（石膏），是比较容易得到的甲酸的中和剂，可直接投入到福尔马林溶液中使用，保持溶液pH值在7.0左右。

80-95%浓度的酒精也可作为单纯固定液使用，它的主要缺点是固定后会使组织块收缩比较大，同时因其渗透力较弱，虽然能沉淀球蛋白、白蛋白和核蛋白，但沉淀后的核蛋白仍可溶于水，所以酒精固定后的组织细胞核着色较差，最常用于糖元的固定。

其它常用的单纯固定液还有氯化汞、冰醋酸、苦味酸、重铬酸钾、锇酸、丙酮、铬酸、三氯醋酸等。

2.2 混合固定液

混合固定液是采用两种或两种以上化学试剂混合配成，混合的各种试剂要考虑对组织的互补作用。如固定糖原的Gendre液，其内有乙醇和冰醋酸，其中的乙醇可沉淀糖原，但会使组织收缩，而配以冰醋酸后，因醋酸可使组织膨胀，从而抵消乙醇对组织的收缩，多种化学试剂混合配成的混合固定液则起多种作用，在选择固定液时要考虑每种试剂成份对组织起到的作用。实验室中常见的混合固定液有以下几种。

2.2.1 Bouin液

Bouin固定液是实验室最常用的混合固定液之一，它由饱和苦味酸水溶液、饱和甲醛水溶液和冰醋酸按15：5：1的比例配置而成，固定液中的苦味酸可使蛋白质沉淀并使组织适当硬化，冰醋酸能固定染色质，甲醛水溶液可以调节苦味酸和冰醋酸对组织的膨胀作用。Bouin固定液的渗透速度快，对组织的固定均匀、收缩轻微，适合大多数组织与器官的固定，染色效果较好。

Bouin固定液在配置和使用时应该注意以下几点：

（1）由于苦味酸难以溶解，在配置饱和苦味酸溶液时至少要等静置过夜且容器底部仍能见到苦味酸晶体沉淀方可认为上方苦味酸溶液为饱和溶液;

（2）由于固定液渗透能力较强在使用时要注意固定时间不要太长，小的组织块一到数小时即可，较大的组织块可以适当延长固定时间，但也不应超过24小时;

（3）Bouin固定液固定后的组织块上容易产生苦味酸的黄色沉着，可在固定后用70%酒精洗去，少量的黄色沉着不影响染色，但在后期观察时要予以区别辨认。

2.2.1 Zenker液和Helly液

Zenker固定液也是组织学切片中常用的固定液，它按升汞（氧化汞）5.0g、重铬酸钾2.5g、硫酸钠1.0g、蒸馏水100ml和冰醋酸5ml比例配置而成，配制时将重铬酸钾、升汞和硫酸钠溶于加温的蒸馏水制成储存液，冰醋酸临用前加入。其中硫酸钠为经典配方中含有，目前普遍认为硫酸钠在此固定液中不起任何作用，常舍去不用，经Zenker固定液固定的组织，细胞核和细胞质染色效果都比较好，但在配置和使用时应该注意以下几点：

（1）储存液需避光放置棕色玻璃瓶中保存;

（2）组织固定的时间控制在12-24小时左右，不应超过24小时;

（3）因固定液中含重铬酸钾，故固定后的组织块需经流水冲洗24小时以上方可进入后续步骤;

（4）因为汞易在组织内形成结晶不利于切片和观察，故冲洗后必须在70%的酒精中加碘去汞（一般为0.5%的碘酒精），去汞后再用5%的硫代硫酸钠去除碘的黄色。

把Zenker固定液用甲醛饱和水溶液替代则为Helly液，故Helly液又常被称Zenker-formol固定液，Helly液对细胞质的固定较好，适合白细胞颗粒、胰岛和脑垂体前叶各细胞等的固定。

2.2.3 Carnoy液

Carnoy液按无水乙醇60ml、三氯甲烷 30ml和冰醋酸10ml比例配置而成，其中无水乙醇用于固定细胞质，冰醋酸固定染色质，Carnoy液常用于糖原、尼氏体和肌纤维等染色，经其固定的组织块适合甲绿-派洛宁法染色显示DNA和RNA。

2.2.4 中性甲醛固定液

中性甲醛也是實验室常规使用的固定液之一，它由磷酸二氢钠4.0g，磷酸氢二钠6.5g，37%甲醛100.0ml，蒸馏水900.0ml按比例充分混合而成，适合大多数组织病理标本的固定，且标本可以在其中长期保存，中性甲醛固定液的渗透能力强、组织收缩小，大多数的抗原物质在其中保存较好，故常在免疫组织化学实验时使用。

其他常用的混合固定液还有4%多聚甲醛固定液、Orth液、Regaud液、Susa液、酒精-甲醛液、乙醚-酒精液等。

3 讨论

良好的固定是组织学制片、大体标本保存以及其他科学实验的基础，即使前期取得的材料很好，如果固定不当，也无法得到满意的切片和实验结果，很多从事科研实验的老师和同学经常忽视了固定液选择的重要性[7-9]，在固定液的选择上很随意，或者有时为了方便就从实验室现有的固定液中选取一种使用，不仅可能浪费材料，而且还常严重影响了实验结果却仍不自知，笔者结合自身从事人体解剖与组织胚胎学实验工作以来的经验教训[10-12]，围绕实验室常用的组织固定液及其分类做一个简单的探讨以期对广大实验和科研人员在固定液的正确选择上有所提醒和帮助。

【参考文献】

[1]杜卓民.实用组织学技术[M].北京：人民卫生出版社，1982，17-32.

[2]李继承.组织学与胚胎学实验技术[M].北京：医药科技出版社，2010，1-42.

[3]姚建设.提高组织切片标本质量的要点[J].解剖学杂志，2012，35（5）：686-689.

[4]姚建设.组织切片标本的质量评价[J].解剖学杂志，2010，33（6）：852-853.

[5]马云，张燕，孙长华.固定液对原位杂交的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2002，11（3）：345-346.

[6]周会芹，杨江辉，余琦.不同组织固定液对免疫组化结果的影响[J].诊断病理学杂志，2009，16（6）：478.

[7]唐从国.几种常用病理组织固定液的比较[J].中国现代医药杂志，2015，17（10）：110-112.

[8]戴军，谢敏浩，沈海燕.使用环保组织处理试剂的应用体会[J].临床与实验病理学杂志，2009，25（2）：219.

[9]吴平，张声.无醛固定液与甲醛固定液对组织形态学保存效果比较[J].临床与实验病理学杂志，2015，31（3）：343-345.

[10]吴敏，胡天寒，吴让让.一条新发现的颈丛无名神经的解剖与观察[J].南方医科大学学报，2018，38（10）：1261-1265.

[11]吴敏，胡天寒，姚建设.大动脉切片标本的制作体会[J].解剖学杂志，2013，36（5）：993-994.

[12]吴敏，胡天寒，姚建设.甲苯胺蓝快速显示肥大细胞的制作方法探讨[J].四川解剖学杂志，2013，21（1）：11-12.