响应面法优化菌种Acinetobacter gerneri CLX-6降解苯胺印染废水

蔡 莉，王 敏

（1.江阴职业技术学院化纺系，江苏江阴 214405；2.江阴市产品质量监督检验所，江苏江阴 214431）

随着印染技术的发展以及多元化的社会需求，丰富多彩的印染类产品日益深入人们的日常生活。其中，苯胺类化合物作为印染过程中的重要中间体，应用较广泛[1]。由于苯胺类化合物具有水溶性强、难以降解、强致癌等特点，已被国家列为重点防控的环境污染物黑名单，各地环保部门对印染类企业排放废水中的苯胺质量浓度均有明确的要求（低于1 mg/L）[2-3]。根据文献报道，目前处理含苯胺的废水主要有三种方法：物理法、化学法及生物法[4]，生物法经济、环保，运用日趋广泛。近年来，国内外学者纷纷对苯胺降解微生物开展了多方面的研究，据报道，研究人员已从环境中成功分离出了一些苯胺类降解菌，主要包括好氧菌和厌氧菌两大类[5]，如Emtiazi G 和Satarii M 从废水处理厂污泥曝气池中分离出真菌镰刀霉（Fusarium.sp）[6]。针对自筛菌种CLX-6 进行苯胺降解特性研究，通过单因素实验确定对苯胺降解起显著作用的环境因素（温度、pH、氧气等），确定考察因素的具体数值，再通过响应面分析法在一定水平范围内求出最佳降解条件，为大规模在含苯胺印染废水中应用提供理论依据。

1 实验

1.1 菌源与培养基

菌种来源：菌种Acinetobacter gerneriCLX-6 由本实验室筛选并保藏。培养基/模拟废水母液[7]：苯胺1 g，酵母粉 4 g，玉米浆9 g，硫酸镁2 g，氯化钠 2 g，pH=7.0，水1 L。

1.2 苯胺检测方法

采用N-（1-萘基）-乙二胺偶氮法测定苯胺质量浓度，按下式计算得到苯胺降解率[8]。

1.3 菌种固定化

分别采用海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠+羧甲基纤维素钠作为固定化载体，制作菌种Acinetobacter gerneriCLX-6的固定化小球[9]。

1.4 菌种降解特性研究

分别研究温度、pH、供氧等环境因素对菌种CLX-6 苯胺降解率的影响，最后得到菌种的单因素培养条件。

1.5 响应曲面实验设计

对以上一系列单因素条件运用旋转中心复合设计法，选择对实验结果具有显著效应的因子，得出影响Acinetobacter gerneriCLX-6 摇瓶降解苯胺的最佳工艺。

2 结果与讨论

2.1 菌种CLX-6降解苯胺的单因素实验

2.1.1 不同固定化方法

为保留菌种固有的催化活性，并增加菌种的重复和连续使用性，将微生物限定在凝胶的微小格子或微胶囊等有限空间内，同时，让基质渗入和产物扩散出来，尝试用不同的载体固定化菌种。以游离菌作为对照，分别将海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠+羧甲基纤维素钠（体积比1∶1）包埋制备的菌种CLX-6小球置于模拟废水中[10]，48、72 h后分别测定苯胺的降解率，并观察小球的变化情况，结果见图1。

由图1可知，以游离菌为对照，通过三种不同材料固定的菌种小球对苯胺去除率的高低顺序依次为海藻酸钠+羧甲基纤维素、海藻酸钠、羧甲基纤维素，分别为80.11%、72.86%和55.28%。实验过程中发现，用海藻酸钠+羧甲基纤维素固定后的菌种小球对苯胺的降解率最高，同时，固定后的小球弹性和机械强度均较好，没有消融现象；以羧甲基纤维素为固定化载体的小球苯胺降解率最低，且固定的小球有消融现象，粘连较多；以海藻酸钠为固定化载体，苯胺降解率、机械强度、通透性等方面介于两者之间。因此，本实验选择用海藻酸钠+羧甲基纤维素作为固定化载体。

2.1.2 温度

外在环境温度的改变将直接影响微生物体内的生化反应，从而影响菌种降解苯胺的效率。因此，设置15、20、25、30 和35 ℃这五个温度梯度来观察菌种CLX-6对温度的适应性。

由图2可知，在15～35 ℃范围内，菌种 CLX-6 都能较好的降解苯胺，说明该菌种具有较宽的温度适应范围，当温度达到30 ℃时，菌种对苯胺的降解率将达到87.72%。

2.1.3 pH

自然界中微生物对环境pH 的需求不同，大多数微生物嗜中性环境，但印染污水往往偏碱性，因此，研究菌种CLX-6 对环境pH 的需求很有必要。将菌种接种于苯胺质量浓度1 000 mg/L，设置五个pH 梯度（5、6、7、8、9）的培养基中，装液量100 mL、30 ℃条件下培养72 h，测定苯胺降解率，结果见图3。

由图 3 可知，当环境 pH 在5～9 范围内变化时，苯胺均能正常降解，说明菌种CLX-6能适应较广的pH范围；当pH=7 时，苯胺降解率最佳为90.38%；当环境pH进一步上升，苯胺降解率基本维持稳定，说明弱碱性环境有利于该菌体发挥降解能力。

2.1.4 装液量

微生物对氧气的需求是区分好氧菌和厌氧菌的条件，氧气含量的控制将直接影响菌种的生长情况和苯胺降解率。在摇瓶培养时，主要通过控制装液量和摇床转速来调节摇瓶中氧气的含量，本实验主要探讨装液量对苯胺降解率的影响。将菌种接种于苯胺质量浓度1 000 mg/L、pH=7.0的培养基中，500 mL摇瓶中的装液量不断提高（50、100、150、200、250 mL），30 ℃条件下培养72 h，测定苯胺降解率和微生物生物量，结果见图4。

由图4可知，摇瓶中不同的装液量将直接影响菌种CLX-6的生物量和苯胺降解率。当培养基装液量为200 mL 和250 mL 时，苯胺的降解率分别为35.43%和14.72%，吸光度分别为0.216 和0.138；当培养基装液量为50 mL 和100 mL 时，苯胺的降解率为72.49%和90.22%，吸光度为0.364 和0.569；当装液量为150 mL 时，苯胺的降解率和吸光度分别达到92.19%和0.583。因此，菌种CLX-6属于微好氧型微生物。

2.2 中心复合实验优化Acinetobacter gerneri CLX-6降解苯胺培养条件

单因素实验结果表明，影响Acinetobacter gerneriCLX-6 降解苯胺显著影响因子为温度、pH、装液量，以此3个因子为自变量，以苯胺降解率为响应值，设计中心复合实验，各因子的实验水平及编码值见表1，实验设计及结果见表2。

表1 中心复合设计实验因素水平及编码

表2 中心组合实验设计及结果

将表2数据利用Statistica 8.0 软件进行回归拟合分析，获得了CLX-6降解苯胺对温度、pH、装液量的多元回归方程为：Y=12.119 3X1-9.287 4X12+51.527 6X2-13.0628X22-3.2714X3-1.2287X32+1.6976X1X2+1.4384X1X3-1.432 3X2X3+73.325 9。

由表 3 可知，模型显著（F回归=86.23＞F0.05，P＜0.05），失拟项（P=0.102 46＞0.05），失拟性检验不显著，说明该回归模型在所研究回归区域拟合得很好。R2=96.58%，表明模型可用来解释实验结果，根据软件分析结果得到各因素最佳值，拟合方程得到最佳值如表4。

表3 回归模型方差分析表

表4 拟合方程拟合后的极值

运用Statistica 8.0软件做出各影响因子之间相互作用与对应的响应值的等高线和响应面图，具体见图5～7。

比较苯胺降解率回归方程的解，各因素的取值基本相近，为实验操作的方便，确定环境温度33 ℃、pH=6.0、装液量180 mL，通过三次验证实验证明模型可靠性，得出苯胺降解率分别为96.67%、96.75%、96.29%。由结果可知，实际测定结果较预测值略低，但也证明了模型有效性，存在极大值点，具有指导意义。

2.3 实际印染废水处理效果

为验证优化菌种CLX-6 降解苯胺的效果，取含苯胺印染废水为实验对象，在优化培养条件（培养温度 33 ℃、培养 pH=6.0、装液量 180 mL）下，72 h 后取样观测固定化后菌种CLX-6使用频率对苯胺降解率的影响。由表5可知，固定化菌种CLX-6连续使用四次后，苯胺降解率仍能达到92.18%，但第五次使用效果不理想，仅为84.62%，且固定化小球出现部分粘连现象，弹性变差，个别小球出现挤压变形、破裂。因此，固定化后的小球在使用过程中稳定性提高，重复使用四次后，苯胺降解率仍可以达到92.18%，该特性适合在实际处理含苯胺的废水中使用。

表5 固定化菌种CLX-6使用频率对苯胺降解率的影响

3 结论

菌种最合适的固定化载体为海藻酸钠+羧甲基纤维素，温度30 ℃，培养pH=7.0、装液量150 mL 时，菌体对苯胺的降解率为92.19%；以单因素结果为基础，借助于响应面分析法优化降解条件，优化后的条件为：培养温度33 ℃、培养pH=6.0、装液量180 mL，在上述最佳培养条件下苯胺降解率可达96.7%。验证了固定化菌株CLX-6对苯胺降解的有效性和重复利用率。实验结果表明，该菌株适于在苯胺废水处理时推广使用。