3D共培养模型对体外培养兔角膜缘干细胞的影响△

周瑛 孙秋萍 蔡岩 高晓唯

作者单位：830000 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，新疆医科大学(周瑛，高晓唯)；830000 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，解放军第四七四医院眼科(周瑛，孙秋萍，蔡岩，高晓唯)

因角膜疾病、化学烧伤等引起部分或完全的角膜缘干细胞缺失而形成的角膜缘干细胞缺乏症(limbal stem cell deficiency，LSCD)[1]，常引发结膜上皮和新生血管向角膜生长、角膜慢性炎症以及纤维组织内生等病理改变[2]，最终导致角膜失去透明性和屈光功能。角膜缘干细胞(limbal stem cells，LSCs)移植即通过体外模拟角膜缘微环境，构建可移植性角膜缘功能单元(transplantable limbal functional unit，TLFU)用于移植，是治疗LSCD的有效方法[3]，移植成功的关键很大程度上取决于LSCs数量、植入方式、植入后存活率及其功能状态，因此如何高效进行体外扩增LSCs成为一个值得研究的课题。Hosseinkhani等[4]认为在培养皿、培养板等二维(two-dimension，2D)环境中培养细胞，常发生细胞组织架构、机械和生物化学信号以及细胞与细胞之间信息交流的丢失，从而无法真实反映组织生理的复杂性并影响细胞功能，与2D环境相比，三维(three-dimension，3D)支架中的细胞生长持续时间更长，更能维持早期干细胞样性质，因此本实验在前期研究基础上将纤维蛋白胶、羊膜作为载体、牙周膜干细胞作为饲细胞，旨在研究3D环境是否有助于促进兔LSCs增殖，从而为实现体外培养的LSCs移植治疗LSCD提供实验依据。

1 材料及方法

1.1材料

1.1.1实验材料本实验所使用的实验动物均购自于新疆医科大学动物中心，为6个月龄健康雌性新西兰大白兔，体质量约2.0 kg；实验动物及操作经过新疆医科大学伦理委员会审核批准并遵循视觉和眼科研究中动物的使用原则。孕妇胎盘羊膜，产前进行母体血清学检查，排除肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，由新疆医科大学第一附属医院产科提供并通过伦理委员会批准及患者与家属同意。牙周膜组织取自新疆医科大学附属口腔医院12～24岁青少年正畸减数拔牙患者，术前告知患者及家属，签署知情同意书并经由伦理委员会批准。

1.1.2主要试剂与仪器DMEM/F12(11)培养基、DisepaseⅡ购自美国Gibco公司，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、α-MEN培养基购自美国Hyclone公司，兔单克隆抗体p63(ab124762)购自美国Abcam公司，外用冻干人纤维蛋白黏合剂购自上海莱士公司。激光共聚焦显微镜、倒置显微镜购自德国Leica公司。

1.2方法

1.2.1人牙周膜干细胞的分离、培养、鉴定人牙周膜干细胞(human periodontal stem cell，HPDLSCs)的分离采用酶解组织块法，以提高原代细胞的存活率[5]。收集临床正畸减数拔牙患者的离体牙，浸泡于含10 g·L-1双抗的PBS中20 min，PBS冲洗牙体3次，刮取牙根中1/3牙周膜组织，并使用眼科剪将其剪碎成2 mm×2 mm×2 mm大小的组织块，经 Ⅰ 型胶原酶37 ℃消化后全培养基重悬，将组织块与重悬细胞置于直径为60 mm培养皿中，于37.5 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，每2 d换液，待细胞生长汇合后胰蛋白酶消化传代培养，取生长状况良好的第三代细胞进行流式细胞鉴定。

1.2.2饲养层HPDLSCs的准备取生长状况良好的第三代HPDLSCs用于实验，逐渐将HPDLSCs全培养液替换为LSCs全培养液以适应共培养条件，用4 mg·L-1丝裂霉素C作用于HPDLSCs 2 h，PBS冲洗3次后胰蛋白酶消化，以每孔为5×103个接种于24孔板中，置于37.5 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中过夜备用。

1.2.3羊膜载体的制备取健康产妇的胎盘，无菌条件下钝性分离羊膜，浸泡于含青链霉素混合液(11)的PBS中20 min，使用PBS清洗羊膜3次，每次5 min，将清洗干净的羊膜上皮细胞面向上贴附于无菌硝酸纤维素膜上，修剪成7 mm×7 mm×7 mm小块。取两块分别置于铺有HPDLSCs的24孔细胞培养板中，加入500 μL LSCs全培养液，置于 37.5 ℃、体积分数为5%CO2的培养箱中静置待用。

1.2.4纤维蛋白胶载体的制备按照说明书制备纤维蛋白原溶液、凝血酶溶液，将混合液(11)注入24孔细胞培养板中，轻轻振荡使之均匀铺满皿底，室温静置成胶后即为纤维蛋白胶载体。取两块纤维蛋白载体分别置于铺有HPDLSCs的24孔板中备用。

1.2.5兔LSCs的分离及3D共培养模型的建立利多卡因麻醉处死新西兰大白兔2只，无菌条件下摘取4只眼球，用含3 g·L-1双抗的PBS冲洗3次，剪除角巩膜缘处结膜、虹膜组织，剪取角膜缘内外各1 mm角膜缘组织，PBS冲洗后依次用2.4×10-3U·L-1DisepaseⅡ37.5 ℃消化15 min、胰蛋白酶 37 ℃消化5 min，离心去上清，全培养液重悬，单细胞悬液以每孔5×104个的密度分别接种于羊膜载体和纤维蛋白胶载体上。将实验分为3组：纤维蛋白胶组为HPDLSCs、纤维蛋白胶和兔LSCs 3D共培养；羊膜组为HPDLSCs、羊膜和兔LSCs 3D共培养；对照组为HPDLSCs和兔LSCs共培养；各组均置于37.5 ℃、含体积分数为5%CO2培养箱中培养，每2 d换液，每天使用倒置显微镜观察细胞生长状况。

1.2.6LSCs形态学观察共培养5 d后，去除饲养层细胞，戊二醛固定纤维蛋白胶组、羊膜组、对照组细胞，叔丁醇梯度脱水，冷冻干镀金属膜后进行扫描电镜观察；分别取纤维蛋白胶组、羊膜组细胞载体复合物及对照组细胞行HE染色。

1.2.7LSCs的鉴定取纤维蛋白胶组和羊膜组细胞载体复合物冰冻切片以及对照组兔LSCs与HPDLSCs共培养24孔板，使用多聚甲醛固定 0.5 h，PBS冲洗3次后使用体积分数1%山羊血清封闭，一抗选用LSCs阳性标志物p63，二抗选用山羊抗兔多克隆荧光抗体避光孵育，激光共聚焦显微镜采集图像。

1.3统计学处理采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析，经K-S检验证实符合正态分布，Levene检验检查方差齐性，各实验组及对照组LSCs的p63阳性率的总体比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1HPDLSCs的鉴定

2.1.1HPDLSCs的形态学观察到原代HPDLSCs培养至3 d时可见细胞爬出，细胞形态呈长梭形及三角形，培养至7 d时有大量细胞于组织块周围呈放射状生长，原代细胞在培养至10 d时传代，传代后细胞贴壁呈长梭形，P3代细胞生长基本稳定，形态一致(图1)。

2.1.2HPDLSCs表面标志物的表达流式细胞检测结果显示，间充质干细胞表面标志物CD90(74%)阳性表达，造血干细胞表面标记物CD34(3%)阴性表达。

2.2LSCs的鉴定

2.2.1LSCs的形态学观察倒置显微镜观察细胞，共培养5 d后融合达80%，培养过程中见饲细胞

HPDLSCs量逐渐减少。扫描电镜结果显示：纤维蛋白胶载体和羊膜载体呈不规则网格状的立体空间结构，表面纵横交错，各孔隙间相互连接；纤维蛋白胶组及羊膜组培养的LSCs均匀附着在载体骨架上，并可观察到分裂象的细胞(图2A至C)；HE染色见LSCs呈圆形或椭圆形，纤维蛋白胶组和羊膜组细胞数量相对较多，而对照组细胞排列相对稀疏(图2D至F)。

2.2.2LSCs的免疫组织化学观察共培养第5天，对各组培养的细胞行免疫荧光染色检测LSCs阳性标志物p63的表达(细胞核发出红色或绿色荧光则为p63阳性细胞)见图3。纤维蛋白胶组、羊膜组及对照组的p63阳性率分别为(69.93±8.76)%、(78.36±8.56)%、(58.59±8.31)%，三组间总体比较差异有统计学意义(F=9.43，P=0.000)，两两比较，纤维蛋白胶组、羊膜组p63阳性率均大于对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，纤维蛋白胶组和羊膜组的p63阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 P3代HPDLSCs细胞形态

图2 LSCs共培养扫描电镜和HE染色图。A：纤维蛋白胶组扫描电镜图；B：羊膜组扫描电镜图；C：对照组扫描电镜图；D：纤维蛋白胶组HE染色图；E：羊膜组HE染色图；F：对照组HE染色图

图3 LSCs共培养免疫荧光染色图。A：纤维蛋白胶组DAPI染色；B：纤维蛋白胶组p63染色；C：纤维蛋白胶组二者合成图；D：羊膜组DAPI染色；E：羊膜组p63染色；F：羊膜组二者合成图；G：对照组DAPI染色；H：对照组p63染色；I：对照组二者合成图

3 讨论

本实验在前期研究的基础上，以HPDLSCs作为饲养层，纤维蛋白胶和羊膜作为载体，构建体外培养LSCs的3D模型。HE染色显示，细胞均匀附着于载体骨架，扫描电镜下可见载体骨架的3D空间结构，为细胞所需营养物质的流通提供通道，载体骨架上的细胞形态饱满，呈圆形或卵圆形，镶嵌排列呈铺路石状，初步说明所制备的纤维蛋白胶载体和羊膜载体具有较好的生物相容性。免疫荧光染色显示，LSCs标志物p63阳性表达，说明3D培养模型中培养的LSCs维持干细胞特性，纤维蛋白胶组和羊膜组与对照组间p63阳性率的比较差异均具有统计学意义，说明在纤维蛋白胶载体和羊膜载体上培养的兔LSCs生长速度快，较无载体状态具有较强的增殖能力，这个结果与胡蓉等[6]所得结果相似。

干细胞的自我更新及未分化状态的保持主要依赖于生存的微环境，这种微环境包括细胞外基质和壁龛内细胞、细胞因子等的相互作用[7]，因此饲养层与LSCs的共培养仍受到广泛关注。近些年，国内外学者对人源性饲养层HPDLSCs[8]、人角膜缘间充质细胞[9]及人脂肪源性干细胞[10]等，替代鼠源性3T3饲养层做了大量研究以解决小鼠来源3T3饲养层带来的异种分子污染、免疫排斥反应及种间病毒转移等潜在危害。本实验采用HPDLSCs作为饲养层，流式细胞术检测显示，其间充质干细胞表面标志物CD90高表达(74%)，造血干细胞表面标志物CD34低表达(3%)，说明HPDLSCs具有间充质干细胞特性，此结果与张文等[11]所述结果相似；同时HPDLSCs具有成骨和成脂能力，由此证明HPDLSCs可作为理想的饲养层细胞[12]。培养过程中我们发现，对照组HPDLSCs随着LSCs增多逐渐减少，由此我们推测，2D环境下LSCs和饲养层细胞竞争生长表面，这种生长区域的竞争可能导致饲养细胞数量的减少，从而导致养分供应不足，在一定程度上限制了LSCs的增殖。基于以上理论和实验数据，我们分别构建了以纤维蛋白胶和羊膜为载体的3D细胞构建体作为细胞生存的细胞外基质，模拟体内组织结构和功能。

人羊膜组织由上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层构成[13]。研究表明，保留上皮的新鲜羊膜能够分泌多种具有生物活性的细胞因子，如表皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和转化生长因子β等[14]，它们参与细胞反应，包括增殖、迁移、存活和细胞外基质的沉积与组织重塑。此外，羊膜基底层致密呈半透明状，富含Ⅳ型胶原纤维网、层粘连蛋白和蛋白多糖等物质，具有促进细胞黏附、移行及分化的功能[15]。本研究发现,羊膜组培养的LSCs p63阳性率最高且细胞与载体骨架复合良好，说明与纤维蛋白胶载体和2D培养环境相比，羊膜更好地模拟了LSCs生长微环境。

纤维蛋白胶是美国食品药品监督管理局批准的使用于人体的一种生物材料，是凝血酶对纤维蛋白原的凝血级联反应的产物[16]，无毒副作用和其他不良影响，它的力学性能可以通过其厚度、支点数、孔隙率和凝胶的渗透性等变量来描述，这些参数在很大程度上取决于聚合条件，如纤维蛋白原、凝血酶的浓度、pH、温度和其他血浆蛋白的存在[17]，比如Linsley等[18]认为，随着纤维蛋白原浓度的增加，支架中间充质干细胞的增殖呈下降趋势。有研究报道在介导细胞间信号转导方面，纤维蛋白优于其他细胞外基质，同时它具有较好的组织相容性，易于体内降解[19]，是比较理想的组织工程载体。不足之处是，它不含有促进细胞增殖和分化的生长因子[20]。本实验，我们发现扫描电镜下纤维蛋白胶载体网格状结构较羊膜疏松，因此我们推测，疏松的网格状结构有利于增加饲细胞与LSCs之间的相互作用以促进LSCs的增殖。

综上所述，本实验通过构建LSCs-纤维蛋白胶载体- HPDLSCs、LSCs-羊膜载体- HPDLSC和LSCs-HPDLSCs三种不同的共培养模型，比较不同培养模型下的细胞生长情况和生物学特性，发现3D共培养模型(LSCs-纤维蛋白胶载体- HPDLSCs和LSCs-羊膜载体- HPDLSCs)培养的细胞在干细胞增殖方面占有优势，因此我们认为LSCs 3D共培养模型的建立有助于体外扩增兔LSCs，为下一步将3D培养的LSCs移植于LSCD的实验研究提供基础。3D细胞培养在组织工程、再生医学、药物研发和毒性测试等方面有巨大发展潜力，但也有一些问题尚待解决，例如对细胞外基质与干细胞之间的作用机制的探索不够彻底、如何使用传统显微镜观察位于高散射介质的不同深度的细胞以及如何进一步优化干细胞生存的微环境等，如果这些问题都能得到进一步的解决，相信干细胞应用于临床治疗的前景必将十分光明，对现代医学的发展也将产生极大的促进作用。