猪圆环病毒3型夹心ELISA诊断方法的建立

于俊楠 陈 媛 彭尧舜 金宜顺 罗莉妍 陈梅芳

(福建农林大学动物科学学院 福州 350002)

猪圆环病毒3型 （Porcine circovirus serum type 3，PCV3）是新发现的圆环病毒，二十面体结构，无囊膜，直径17～20 nm[1]。2016年在美国首先报道该病毒的存在[2-3]，随后陆续有报道显示PCV3型病毒也广泛存在我国境内[4]。综合国内外报道，该病毒与心脏和多系统疾病、猪皮炎肾炎综合征、繁殖障碍类 疾病存在密切联系[2-3,5]。PCV3和PCV2衣壳蛋白Cap同源性仅为30%左右[6]，现有的PCV2疫苗无法对PCV3进行有效防控，PCV3对生猪养殖所造成的损失进一步加大，有效地检测场内的PCV3感染率是对其进行防治的首要任务。

ELISA方法是市场应用面极大的一项血清学诊断技术，其原理简单，操作简便、灵敏、快速，适用于大量样品的检测，从抗原性和结构上可知，PCV2和PCV3不具有交叉免疫保护的特性。Cap蛋白作为PCV3的主要抗原性携带的结构蛋白，使其成为在血清学上检测PCV3的理想抗原。为满足生产上大批量、低成本、快速的检测需求，本研究将重组PCV3 Cap蛋白的单克隆抗体作为包被抗体，以抗Cap蛋白兔多抗为检测抗体，优化反应条件构建检测PCV3的夹心ELISA方法。测试该方法的特异性、敏感性和重复性以实现预期的目标。临床检测结果良好，该诊断方法的建立对于PCV3的快速诊断具有很大意义。

1 材料与方法

1.1 病毒、试剂、仪器 已纯化的PCV3重组Cap蛋白（18 μg/mL）、PCV3 Cap 蛋白单克隆抗体由本实验室制备保存，猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）及 PCV2 Cap 蛋白均由实验室制备保存；新西兰黄兔从福建农林大学兔园购买；碳酸盐缓冲液（PBS）购买自武汉赛威生物技术有限公司；Tween-20购自国药集团化学试剂有限公司；ELISA相关试剂、羊抗兔HRP-IgG、酶标板均购自北京索莱宝科技有限公司；MultiskanGo新一代全波长酶标仪（Thermo）。

1.2 单克隆抗体的纯化 在-80℃下取出抗Cap单抗腹水，并通过硫酸铵-辛酸沉淀法进行纯化[7]：调节腹水pH至4.8；加入1/25体积辛酸并搅拌；静置离心，取上清调节pH至7.2，50%硫酸铵沉淀，将沉淀溶解在PBS中，再用45%硫酸铵二次沉淀，PBS溶解沉淀，透析过夜；离心取上清，测定蛋白质含量，并稀释至工作浓度。

1.3 兔多克隆抗体制备与测定 将Cap蛋白与完全弗氏佐剂混合（比例为1∶1），皮下注射新西兰黄兔（首次免疫），15 d后进行第二次免疫，该程序与第一次免疫相同。二免15 d后，改用不完全弗氏佐剂和Cap蛋白1∶1重新混合进行再次免疫，免疫5 d后收集兔血清，收集空白组兔血液作为阴性对照，间接ELISA测定阳性血清效价。

1.4 单抗最佳包被浓度的确定 将纯化的单抗用包 被 液 稀 释 至 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800 包 被 于ELISA 板中，100 μL/孔，重复 3次，并在 4℃冰箱保存过夜；第2 d倒出板中的液体，用含有0.05%吐温的PBS冲洗，拍干孔内液体，再次加入100 μL封闭液，在湿盒中 37 ℃下封闭 l h；洗涤；加入 100 μL（1∶20）待检样品，37℃湿盒孵育1 h；洗涤；各孔加入100 μL （1∶4 000）PCV3 阳性血清，37 ℃湿盒孵育1 h；洗涤；将稀释后的羊抗兔 HRP-IgG（1∶5 000）加入 ELISA 板中，100 μL/孔，37 ℃湿盒孵育 l h；洗涤； 加底物 TMB 显色液 （100 μL/孔），37℃显色20 min；向各孔加入100 μL终止液，15 min内在酶标仪中测OD450值；根据各孔OD值计算P/N值，判读结果。

1.5 包被条件的选择 锁定试剂最佳作用浓度，其他条件均不改变的前提下，同一时间段进行两组包被条件的选择（4℃过夜，37℃、2 h）。

1.6 一抗最佳作用浓度的确定 保持单抗包被浓度 不 变 ，PCV3 阳 性 血 清 按 照 1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000 的比例稀释，其他操作同 1.4。

1.7 酶标二抗最佳作用浓度的确定 保持单抗包被浓度、PCV3阳性血清作用浓度不变，将羊抗兔HRP-IgG 按 1∶5 000、1∶10 000 两个梯度进行操作，其他操作同1.4，读取OD450nm值选择酶标二抗最佳作用浓度。

1.8 临界值判定 使用建立的夹心ELISA方法，检测本实验室制备的28份猪PCV3阴性样品的OD450值。计算平均值(X)和标准差(SD)，阳性临界OD450值≥X+3SD；阴性临界OD450值≤X+2SD，介于之间者判定为可疑。

1.9 特异性试验 使用建立的夹心ELISA方法检测猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪伪狂犬病病毒 （PRV）、PCV2和PCV3阳性样本，测试建立的夹心ELISA方法的特异性。

1.10 重复性试验 用制备的同批次和不同批次的包被板，不同时间检测3种不同梯度的阳性样品，每组样品进行3组重复，计算标准差和变异系数，并分析组内和组间重复性。

1.11 临床应用 建立的夹心ELISA诊断方法和现有的PCR诊断方法同时用于检测收集的19份不同猪的不同组织，比较两种方法的测试结果，并评估该方法的临床适用性。

2 结 果

2.1 单抗纯化 辛酸-硫酸铵蛋白沉淀法纯化之后，测定蛋白含量为1.2 mg/mL，用PBS稀释至1 mg/mL，分装保存，进行下一步试验。

2.2 兔多抗血清的制备与鉴定 最后一次注射3 d后收集血清，通过间接ELISA测定效价达到1∶16 000，具体数据见表1。

2.3 夹心ELISA最佳工作条件的确定 根据预试验，固定重组蛋白液的稀释比例为 1∶20，即 0.9 μg/mL。控制包被抗体作为单一变量，将P/N最大值的包被量（10 μg/mL）定为最佳浓度，结果见表 2。

表2 单抗包被浓度筛选结果

以最佳包被浓度包被单抗，控制一抗作为单一变量，结果见表3，确定一抗最佳稀释浓度为1∶4 000，此时阳性对照OD450值最接近1。

表1 兔猪阳性血清抗体效价检测

表3 一抗最佳作用浓度结果

在先前确定浓度的基础上，将酶标二抗羊抗兔HRP-IgG 分 1∶5 000、1∶10 000 进行对比， 推荐使用量1∶5 000更为合适，结果见表4。

表4 羊抗兔IgG浓度筛选结果

按照最佳试剂作用浓度，改变包被条件。表5试验结果显示，包被条件4℃过夜略优于37℃、2 h。

表5 包被条件筛选结果

2.4 临界值判定 通过对28份阴性样品的测试，测得450 nm下的OD值，计算平均值与标准差，结果显示平均值为0.2048，标准差为0.0687。以X+3SD为阳性临界，X+2SD为阴性临界。即OD值超过0.4110为阳性，低于0.3423为阴性，介于0.3423～0.4110为可疑。具体数据见表6。

2.5 特异性试验 对实验室保存的猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、PCV2和PCV3蛋白样品进行检测，结果见表7，未发现该方法存在交叉反应，无关病毒检测阴性，该方法有良好的特异性。

2.6 重复性试验 用制备的同批次和不同批次的包被板，不同时间检测3种不同梯度的阳性样品，每组样品进行3组重复，并计算其标准差和变异系数，分析其组内和组间重复性。结果显示该方法可重复性良好，批内和批间的变异系数均处于5%内。具体结果见表8-表9。

2.7 临床应用 用建立的夹心ELISA诊断方法和已有的PCR诊断方法分别对采集的19份不同猪不同组织进行检测，结果见表9。建立的夹心ELISA方法检测出11份阳性；而PCR检测结果阳性13份，阴性6份，该诊断方法与PCR方法符合率达到84.6%，总体效果仍然相对比较理想。结果也表明淋巴结样品OD值高于同源其他组织样品，推测所含病毒量较其他组织会有差异。

表6 28份阴性样品测试结果

表7 夹心ELISA特异性检测结果

表8 批内重复性试验结果

表9 批间重复性试验结果

表10 两种方法临床检测结果

3 讨 论

PCV3对生猪养殖行业的危害日趋加重，对其防治也逐渐为各国所重视，目前对于PCV3的检测手段有仅限于分子生物学和血清学检测，未发现有成功分离病原的报告[4]。也只有ELISA检测对试验条件要求较低，库旭刚等[8]针对PCV3的ORF2基因表达进行间接ELISA方法的建立，宋长绪[9]申请间接ELISA检测试剂盒专利，都是围绕间接ELISA方法来实现的。

对于圆环2型病毒，有进行夹心ELISA诊断方法建立的先例[10]，故PCV3的夹心ELISA也具有实践可行性。本试验是在实验室制备的抗Cap蛋白单抗隆抗体的基础上进行的，试验过程中也发现有很多可以提高检测结果可靠度的操作。在洗涤操作中，洗涤五次的同时加大洗涤液的用量，可以很好地将离散度控制下来；同时在对不同组织的检测中也发现，不同组织检测的OD值存在差异，推测不同组织的含毒量会有所不同，需要进一步验证。

总之，基于最佳反应条件下夹心ELISA检测方法的特异性、灵敏性和可重复性，在临床初步测试中表现良好，与PCR符合率达到84.6%。对于流行病学调查、猪场的一般检测具有一定的意义。