生长调节剂处理的洒金柏扦插不定根解剖学研究

赵今哲 刘国彬 张鸿翎 曹 均 张玉萍 廖 婷 王 烨 郭丽琴

( 1. 内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2. 北京市林业果树科学研究院，北京 100093)

洒金柏（Platycladus orientalis）为柏科（Cupressaceae）侧柏属（Platycladus）植物，属于侧柏的变种[1]，春夏叶表层淡黄绿色，秋渐变为金黄色，入冬转褐黄色，具有较高的观赏价值。适宜孤植或丛植，可广泛应用于园林绿地、道路绿化等方面，是园林绿化针叶树种的优异资源，目前针叶树种主要繁殖方式有种子繁殖、嫁接和扦插。其中种子繁殖后代遗传变异大，优良性状不易保持；嫁接繁殖愈合周期长，繁殖量小；扦插繁殖生产量大、成本低，是无性系培育的主要方法。20世纪80年代末，全国侧柏协作组开始侧柏种源调查及扦插繁殖研究，发现侧柏扦插以春季（5—6月）和秋季（11月）为佳，高浓度粉剂生根促进剂速蘸比低浓度溶剂浸泡24 h效果好[2]。魏黔春[3]发现可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白等营养物质变化与插穗生根所需要的能力呈消长关系；内源激素含量变化与侧柏插穗生根关系密切，吲哚乙酸/脱落酸（IAA/ABA）比值越大，吲哚乙酸/玉米素核苷（IAA/ZR）比值越小，越利于插穗生根。作为侧柏的变种，洒金柏研究相对落后，关于洒金柏扦插生根过程中插穗内部组织结构变化情况未见研究。本研究在课题组针叶植物扦插繁殖技术体系建立的基础上，从解剖学角度对洒金柏1年生半木质化插穗不定根发育过程中的外部形态和组织结构进行观察，为揭示洒金柏不定根发生的细胞学机制提供形态解剖学依据。

1 材料及方法

1.1 试验地点

试验所用洒金柏半木质化插穗来自北京市林业果树科学研究院针叶植物资源圃，品种为优1031，16年生。扦插试验和解剖学实验分别在北京市林业果树科学研究院针叶植物繁育智能温室和林木资源育种实验室进行，扦插试验于2017年7月进行。

1.2 插穗采集与处理

取健康的1年生半木质枝条，剪成长约15 cm的插穗，顶部3～4组叶片，现采现插。使用m（IBA）∶m（NAA）=1∶1的溶液处理插穗，低浓度（40、60、80 mg/L）浸泡4 h，高浓度（200、600、1000 mg/L）速沾10 s，扦插于沙床。以清水浸泡为CK，共设7个处理，每处理重复3次，每重复30根插穗。LK-400自动喷雾设施（北京林科林业技术公司，中国）控制温湿度。

1.3 试验方法

1.3.1 取样方法

洒金柏扦插生根周期长约90 d。取扦插试验中生根率最高的80 mg/L （m（IBA）∶m（NAA）=1∶1）溶液浸泡4 h处理的插穗，前20 d每10 d取样1次，20 d后每5 d取样1次，直至不定根形成，共取样23次。每次随机取5～8株插穗。

1.3.2 形态观察

以洒金柏半木质化插穗扦插生根过程中插穗基部外部形态为观察对象，记录愈伤组织与根系的生长发育状况，CANNON DS126171（佳能株式会社，日本）相机拍照。

1.3.3 组织结构观察

以洒金柏半木质化插穗扦插生根过程中插穗内部组织结构为观察对象。将插穗基部1 cm左右剪下，迅速置于FAA固定液，使用石蜡切片法[4-5]制片。洒金柏木质部较硬将制片方法优化（20%盐酸软化10～24 h，不使用粘粘剂，38℃烘片9～10 h可节约制片时间提高切片质量。），使用KD-3358切片机（上海之信仪器有限公司，中国）切片，厚度为8～12 μm，番红-固绿染色，在Motic SMZ-168显微镜（麦克奥迪（厦门）电气股份有限公司，中国）下观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 不同处理对洒金柏扦插生根的影响

由表1可知，与CK相比，不同处理能极显著提高洒金柏扦插生根率（P＜0.01），可将生根率提高19.00%～70.27%。其中80 mg/L浸泡4 h处理的插穗生根率为91.38%，极显著高于其他处理（P＜0.01），1000 mg/L速沾10 s处理次之，生根率为80.00%显著高于其他处理（P＜0.05）。不同处理对生根量的影响虽不显著，但均高于CK。各处理的平均根长均大于CK，其中600 mg/L速沾10 s处理的插穗平均根长为6.55 cm，显著高于其他处理（P＜0.05）。此外还发现，无论浸泡处理或速沾处理，生根率均随浓度增加而升高。

表1 不同处理对洒金柏扦插生根的影响Table 1 Effects of different treatments on rooting of P. orientalis

2.2 洒金柏扦插生根过程的外部形态观察

从扦插到形成不定根需要约90 d。由图1a可知，洒金柏1年生半木质化插穗表皮黄褐色，韧皮部呈绿色，厚度占木质部的1/2左右。扦插后20 d后，插穗表皮颜色变深，基部出现乳白色愈伤组织。愈伤组织首先出现在基部边缘，渐渐向周围分化，最终将切口全部包住。愈伤组织在形成过程中出现不同的形态变化，新形成的愈伤组织呈乳白色瘤状突起，有发育为不定根的可能；部分愈伤组织出现老化形态逐渐变为棕褐色成丘状（图1b、图1c）。80 d后，发现少量乳白色不定根伸出（图1d）。扦插后120 d部分插穗长出1～3条不定根（图1e），部分插穗形成完整的根系（图1f），部分插穗基部有老化愈伤组织未见不定根（图1g、图1h）。

图1 洒金柏扦插生根过程形态观察Fig. 1 Morphological features of rooting process of P. orientalis cutting

2.3 洒金柏扦插生根过程中组织结构变化

2.3.1 扦插前插穗的组织结构

由图2a1可知，洒金柏插穗基部的横切面由表皮、皮层、维管柱3个部分组成。最外层的表皮细胞为近似圆形，外侧的细胞壁上有角质层。表皮以内是皮层，皮层细胞大小、形状不一，分布较疏松，皮层内有分泌道，没有连续的厚壁组织。皮层以内是维管束为木质部的基本结构。横切面中心为髓，是一团排列疏松的薄壁细胞。木质部可见连接髓与皮层的髓射线。通过大量连续切片观察，在插穗内未发现潜伏根原基。

2.3.2 不定根原基的起源

插穗基部髓射线向韧皮部方向加宽成多列细胞（图2a2），并在髓射线与形成层交汇处形成一团细胞核较大、排列紧密的薄壁细胞团（图2a3）。该细胞团向皮层方向不断分化，发育形成根原始细胞，其周围的韧皮细胞也参与了分化（图2a4），根原始细胞经过不断分裂分化，最终形成不定根原基（图2a5）。此时，不定根内部的维管系统也开始形成。不定根原基随后不断向前分裂挤破皮层伸出形成不定根，不定根的维管系统与插穗维管形成层相连（图2a6）。

图2 洒金柏扦插不定根发生过程Fig. 2 Adventitious root process of P. orientalis cutting

大多数插穗扦插后，韧皮部的薄壁细胞体积变大（图2a2），之后插穗切口处开始形成愈伤组织。愈伤组织形成后，呈横向和径向分裂，并逐渐包围插穗基部（图2b2）。观察发现，束中形成层相接的髓射线细胞恢复分裂能力，转变为束间形成层，其中的薄壁细胞不断分裂，将一部分外围的维管组织向外推挤，这些薄壁细胞连同皮层的薄壁细胞共同分裂产生了愈伤组织（图2a3、图2b1）。愈伤组织内的薄壁细胞不断分裂，分化形成不同的组织：一部分分化形成了输导组织（图2b2）（愈伤组织内的输导组织部分是插穗基部维管组织的延续，图2b3），一部分分化形成了近圆形（鸟巢状）的结节逐渐转化为木质部。在木质部周围有细胞核明显且排列紧凑的的根原始细胞（图2b4），这些细胞群的体积不断扩大并伸长，逐渐生长成一端较尖的根原基（图2b5）。根原基继续向外增殖、伸长，突破愈伤组织表皮形成不定根，不定根的维管系统形成（图2b6）。

2.3.3 不定根的发生过程

根据形态解剖学观察，洒金柏扦插不定根的形成经历了4个连续时期，分别为愈伤组织形成期、不定根诱导期、不定根表达期和不定根伸长期。扦插后0～20 d为愈伤组织形成期，愈伤组织开始发育并逐渐将插穗基部包住（图1a）；扦插后21～40 d为诱导期，插穗切口处的髓射线与形成层相交处以及愈伤组织内的输导组织附近的薄壁细胞分化成根原始细胞（图2a4、图2b4）；扦插后41～70 d为表达期，该阶段根原始细胞开始分化形成根原基，根原基不断伸长并发育出根的基本结构（图2a5、图2b5）；扦插后71～90 d为伸长期，不定根突破皮层或愈伤组织表层，形成肉眼可见的不定根（图2a6、图2b6）。扦插后120 d插穗根系基本完成（图1d）。

3 结论与讨论

大量研究表明，选择最优的外源激素种类、浓度、处理时间等因素组合可以有效的提高植物扦插的生根率、生根条数等[6-7]。IBA、NAA处理可提高插穗内多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）活性，促进插穗内部营养物质的重新分配和内源激素的表达从而促进插穗生根，IBA促进效果略优于NAA[8-10]。本研究中经80 mg/L的m（IBA）∶m（NAA）=1∶1处理的插穗生根率最佳为91.38%，比CK提高了3倍。此外，适宜的育苗基质可提高插穗的生根率及移栽成活率[11]，洒金柏扦插育苗外源激素种类、浓度、处理时间、育苗基质等最优组合有待进一步系统研究。

一般将植物不定根发育的过程划分为3个时期，即诱导期、启动期和表达期[12-13]，根据不定根原基形成时间分为潜伏根原基和诱生根原基[14-15]。本研究根据洒金柏插穗外部形态及其内部组织结构变化，将洒金柏扦插不定根发生发育过程划分为4个连续时期，即愈伤形成期（持续20 d左右）、不定根诱导期（持续20 d左右）、不定根表达期（持续30 d左右）、不定根伸长期（持续20 d左右），因在扦插前洒金柏插穗内未观察到潜伏根源基，所以洒金柏扦插不定根原基属于诱生根原基。

根据插穗不定根的发生部位可将插穗的生根类型分为皮部生根型、愈伤生根型和混合生根型。其中皮部生根型的根原始细胞通常产生于髓射线、形成层以及两者相交处，愈伤生根型的根原始细胞产生于愈伤组织内，混合型生根型则具备以上2种类型的特点[16]。本研究发现，洒金柏插穗不定根原基起源于髓射线与形成层交叉处、愈伤组织2个位点，由愈伤组织伸出形成不定根，仅个别插穗不定根由皮层伸出。因此，洒金柏生根类型为典型的愈伤生根类型。

植物体受到损伤后，内源生长素的合成和移动受到影响，同时激活多个发育调节因子，进而形成愈伤组织[17]。愈伤组织在一定程度上可防止水分散失和细菌入侵，张钢民等[18]研究认为愈伤组织是不定根形成的前提，但白桦（Betula platyphylla）不定根原基先于愈伤组织形成且愈伤组织内未见根原基形成，愈伤组织抑制其不定根形成[19]。在洒金柏扦插生根的过程中，愈伤组织的形成是不定根生长发育的物质基础，多数不定根由愈伤组织形成并伸出体外，但研究同时发现，过度发达的愈伤组织消耗了插穗内大量的营养物质并不断分化增殖，形成了恶性循环，在愈伤组织外层形成褐色硬化表层，进而抑制不定根的发生。植物不定根再生需要经过2次“细胞命运转变”即：形成层细胞转变为愈伤组织细胞再转变为根原基细胞[20]，这与洒金柏不定根的发育模式相似。

植物自身的生根能力和遗传性状在很大程度上决定了扦插的成活率，插穗生根能力与其木质化程度成反比，插穗横切面结构对不定根发育有一定影响[21-22]，在桉树（Eucalyptus robusta）、红恺木（Alnus rubra）等不定根研究中，认为皮层内环状厚壁组织对不定根发育有抑制作用[23-24]，王戈戎等[25]通过对喜树（Camptotheca acuminata）研究认为，插穗横切面内不连续的厚壁组织对不定根发育没有影响。本研究通过连续切片观察在洒金柏插穗横切面未发现厚壁细胞及环状厚壁组织，说明没有阻碍其不定根发育的组织结构。通过对比发现，洒金柏不定根发育的关键因素为激素等生理生化因素。此外，红桤木[24]、杂种鹅掌楸（Liriodehdroh chinense）[26]、合欢（Albizia julibrissin）[27]等树种扦插过程中，部分不定根从插穗皮孔中伸出，此现象未在洒金柏不定根发育过程中出现，与其生根类型有关。

通过对洒金柏扦插不定根形成过程中插穗形态及解剖学观察，初步将洒金柏扦插不定根形成划分为：愈伤形成期、诱导期、表达期、伸长期。不定根形成是一个复杂的动态过程，组织结构的变化只是其中的一部分，今后结合其生根过程的激素调控、基因表达等方面研究，可将其生根机理研究更系统深入，建立完整的不定根形成机制，为洒金柏及其他难生根树种提高生根效果作参考。