云南高黎贡山10种高山雀形目鸟类卵壳显微结构观察

王官胜 王晓彤 梁 丹 罗 旭

( 1. 西南林业大学西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650224；2. 中山大学生命科学学院，广东 广州 510275)

卵是鸟类生长发育的起点，在形态、结构等方面有较稳定的特异性[1-2]，因此备受鸟类学家关注[3-7]。鸟卵壳是由 Ca、P、K 等元素构成[2，5]，硬化的钙质硬壳为胚胎发育提供了一个安全舒适的场所[6，8]。卵壳横截面由外向内分为表面结晶层、栅栏层、锥体层和壳膜层[2，9]，各层之间相互连通[10]，胚胎通过气孔与外界环境进行气体交换、水分蒸发和调节胚内温度[11-12]。卵壳厚度越大，坚固性越好，抗压能力越强[13-14]，越有利于水分保持，但较厚的卵壳却不利于气体交换；鸟类可通过增加气孔数量，来减少厚卵壳对气体交换所产生的负面影响[15-16]。卵壳结构与特定的环境相关[12]，是长期进化过程中对环境压力适应的结果[17-18]。地面营巢的鸟类在卵壳外表面有一层透明蛋白质的保护膜，以防止微生物和病菌侵袭[1，11]。在相同生境中营巢的鸟类，因巢址位置[18-19]、巢类型[20]、产卵数量[21]等存在差异，卵壳结构也会不同。

高海拔地区一般具有氧气稀薄、空气湿度低等气候特点[22]，鸟类的生存压力较大[23]。已有研究发现，相较于低海拔地区繁殖鸟类，高海拔地区繁殖鸟类卵较大、窝卵数较小[24]。孙嘉辰等[12]对青藏高原高寒草甸繁殖鸟研究中发现预期气孔率显著高于气孔率，Rahn等[25]在北美洛基山红翅黑鹂(Agelaius phoeniceus)和喜马拉雅山红原鸡(Gallus gallus)的卵壳研究中，发现低海拔个体的卵壳有效气孔面积显著高于高海拔个体。对家朱雀(Haemorhous mexicanus)的研究发现高湿度区域卵壳厚度和有效气孔面积显著高于低湿度区域，而且卵壳结构受湿度的影响比温度更为明显[26]。

本研究卵壳样品于2015年4、5月采自高黎贡山海拔3000 m以上的高山生境，因受印度洋暖湿季风的影响，该地降雨充沛、空气湿度非常大，年均降水量通常高于3000 mm[27]，与其他高海拔地区相较有显著的高湿度的特征。本研究以该区域同域分布的高海拔雀形目鸟类为对象，通过扫描电镜对鸟类卵壳显微结构特征进行观察分析，探讨物种间显微结构特征的差异，以及鸟卵显微结构特征和筑巢位置的关系。

1 材料与方法

研究共采集了10种鸟16枚鸟卵的卵壳材料，其中白眉林鸲（Tarsiger indicus）、淡背地鸫（Zoothera mollissima）、纯色噪鹛（Trochalopteronsubunicolor）、火尾绿鹛（Myzornis pyrrhoura）、异色树莺（Horornis flavolivaceus）、火尾太阳鸟（Aethopyga ignicauda）各采集了2枚鸟卵；蓝眉林鸲（Tarsiger rufilatus）、黑顶噪鹛（T. affine）、黄额鸦雀（Suthora fulvifrons）、红嘴鸦雀（Conostoma aemodium）各采集了1枚鸟卵。所有鸟卵均采自幼鸟出巢之后或者天敌破坏后被亲鸟遗弃的巢，收集巢中的鸟卵或卵壳，编号后放入自封袋中干燥保存。

卵壳实验处理参照常崇艳等[2]、蒋爱伍等[28]的方法，用镊子在相同部位取下几小块卵壳，用双蒸水浸泡24 h，然后自然风干。将样品编号后粘在日立TM3030型扫描电镜载物台上，观察卵壳的外表面、横截面、栅栏层、壳膜后并拍照，得到卵壳表面光滑度、裂纹、乳突、壳膜纤维、芽突等描述性特征。测量性特征在软件Motic Images Advanced 3.2中进行测量，包括卵壳厚度（μm）、各层厚度（μm）、卵壳表面气孔孔径（μm）、栅栏层蜂窝小孔孔径（μm）、壳膜纤维直径（μm），为获取每个卵卵壳厚度、各层厚度及孔径和直径数据，本研究选择5个不同视野进行观察，每个视野分别拍一张照片取6组数据，每项特征样本量n=30，卵壳厚度为表面结晶层、栅栏层和锥体层之和。统计表面气孔密度（100 μm2内的个数）、栅栏层蜂窝小孔密度（100 μm2内的个数）、壳膜纤维的密度（100 μm2内的条数）。而每个卵的密度数据，本研究选择5个不同视野进行观察，每个视野分别拍一张照片取4组数据，每项特征样本量n=20。测量性特征数据统计值采用平均值±标准差表示。

不同营巢位置卵壳微观结构可能存在差异，本研究将10个物种分为地面营巢和树上营巢两组。对不同营巢位置的鸟卵显微特征进行比较分析，用单样本K-S检验对数据样本进行正态性检验。符合正态分布的数据进行独立样本的T检验，不符合正态分布的数据则采用2个独立样本的K-S检验，上述统计分析在SPSS17.0中完成。

2 结果与分析

2.1 描述性特征比较

对10种雀形目鸟类卵壳的显微结构观察发现，显微结构大体特征相同，卵壳都是由表面结晶层、栅栏层、锥体层和壳膜层构成。在观察鸟卵壳表层时，纯色噪鹛、黑顶噪鹛、淡背地鸫、黄额鸦雀、红嘴鸦雀、蓝眉林鸲卵壳上未观察到表层有透明蛋白质的保护膜，在火尾太阳鸟、火尾绿鹛、异色树莺、白眉林鸲的表层上观察到透明蛋白质的保护膜。纯色噪鹛、黑顶噪鹛、淡背地鸫及白眉林鸲的卵壳表面平滑，而火尾太阳鸟、火尾绿鹛等其他6种鸟类卵壳表面不平滑。在每种鸟卵壳的表面都观察到有裂纹，均呈不规则分布，不同物种之间存在裂纹数量、裂纹长短的差异。纯色噪鹛、火尾绿鹛、异色树莺、红嘴鸦雀的栅栏层结构为平板状结构，其余6种为岩层片状结构。观察到的乳锥形状大致有3种，黑顶噪鹛和火尾绿鹛的卵壳乳锥为球状，白眉林鸲、黄额鸦雀的卵壳乳锥形状为块状，纯色噪鹛、异色树莺、淡背地鸫、红嘴鸦雀、蓝眉林鸲、火尾太阳鸟的卵壳乳锥形状均为花朵状。孵化后卵壳中乳锥形状均为不规则的晶体状，如火尾太阳鸟和火尾绿鹛。在黑顶噪鹛、火尾太阳鸟、火尾绿鹛的壳膜纤维上未见球状芽突，其余7种都具有芽突（见图1、表1）。

图1 卵壳显微结构示意Fig. 1 Eggshell ultrastructures of the study birds

表1 十种雀形目鸟类卵壳显微结构特征对比Table 1 The eggshell ultrastructure traits in 10 passerine species

2.2 可量性特征的比较

对10种鸟类表层孔径和密度、蜂窝小孔孔径和密度，壳膜纤维直径和密度进行测量，结果显示：表层气孔孔径在0.70～1.46 μm之间，表层气孔密度在1.20～7.80 个/100 μm2之间；树上营巢和地面营巢的鸟类表层气孔孔径（P＞0.05）和表层气孔密度（P＞0.05）无显著差异。蜂窝小孔的孔径在0.54～1.01 μm之间，蜂窝小孔密度在12.80～18.86 个/100 μm2之间；树上营巢和地面营巢的鸟类蜂窝小孔密度（P＞0.05）无显著差异，而树上营巢的鸟类蜂窝小孔孔径显著大于地面营巢的鸟类（P＜0.01）。壳膜纤维直径在1.28～2.18 μm之间，壳膜纤维密度在 2.12～4.05 个/100 μm2之间；地面营巢的鸟类壳膜纤维直径（P＜0.01）和壳膜纤维密度（P＜0.01）显著高于树上营巢的鸟类（表2）。

表2 十种雀形目鸟类卵壳特征Table 2 The eggshell traits of 10 passerine species

对10种雀形目鸟类卵壳厚度和各层厚度进行测量，结果显示：黑顶噪鹛卵壳厚度最大，为（87.06±1.31）μm（n=30），蓝眉林鸲卵壳厚度最小，为（33.65±0.51）μm（n=30）（图2）；淡背地鸫表层厚度最大，为（18.68±0.84）μm（n=60），火尾太阳鸟的表层厚度最小，为（6.87±0.84）μm（n=60）；红嘴鸦雀栅栏层厚度最大，为（38.44±1.41）μm（n=30），黄额鸦雀栅栏层厚度最小，为（11.10±1.41）μm（n=30）；淡背地鸫锥体层厚度最大，为（31.87±2.76）μm（n=60），黄额鸦雀锥体层厚度最小，为（7.40±0.88）μm（n=30）（图 3）。

图2 十种雀形目鸟类卵壳厚度对比Fig. 2 The eggshell thickness of 10 passerine birds

图3 十种雀形目鸟类卵壳各层厚度对比Fig. 3 The eggshell thickness of each layer of 10 passerine bird

3 结论与讨论

3.1 鸟卵显微结构的个体差异

对同种鸟类不同个体的显微结构进行观察，纯色噪鹛和淡背地鸫的表面光滑程度、表面裂纹、乳锥形状、栅栏层结构和芽突等各特征均呈现出一致性，但是火尾绿鹛和火尾太阳鸟的乳锥形状和芽突在不同个体间表现出差异性，异色树莺的表面裂纹和栅栏层结构在不同个体间存在差异，白眉林鸲表面光滑程度和乳锥形状在不同个体间也存在差异。这种情况前人研究[2，9]也有发现，说明同种不同个体的卵壳显微特征并非完全一致，某些卵壳显微结构可能会因个体不同或者孵化过程的不同而有特征上的变化，因而选用哪些卵壳显微结构可以对物种进行鉴定，或者说哪些卵壳显微特征具有稳定的物种特异性，还需要更多研究来归纳。如乳锥形状这一特征，常崇艳等[2]研究发现孵化后乳锥形状会由规则的晶体状转变为凹陷且不规则的晶体状，本研究中在火尾太阳鸟和火尾绿鹛也发现类似现象，孵化中的卵壳乳锥形状为块状和花朵状，而雏鸟出壳后乳锥形状变为不规则的晶体状，这至少说明乳锥这一特征在孵化结束后改变很大，在今后的研究中应尽可能采集孵化前期的鸟卵，或者，如果鸟卵采自孵化结束的巢，在进行显微结构观察时可以忽略该项特征。

3.2 蜂窝小孔孔径较大的解释

蜂窝小孔的孔径与鸟类生活的环境密切相关，Becking[17]发现鸟类卵壳内蜂窝小孔的孔径及密度随纬度的升高而下降，并提出热带地区的鸟类蜂窝小孔比高纬度地区的鸟类孔径大，数量多，孔径一般在0.6～1.2 μm之间。本研究中10种鸟类蜂窝小孔孔径多在0.6～1.0 μm之间，与Becking[17]提出的热带鸟类孔径数值相当，应是高黎贡山高山雀形目鸟类应对高湿度环境的一种适应特征。

将本研究与采自同一区域的白尾梢虹雉（Lophophorus sclateri）和血雉（Ithaginis cruentus）的蜂窝小孔的孔径进行比较[14]，发现雀形目鸟类的孔径大于同区域的雉类。这2种雉类以及其他一些雉类的孔径均在0.23～0.36 μm之间，如哈曼马鸡（Crossoptilon harmani）、白冠长尾雉（Syrmaticus reevesii）、白鹇（Lophura nycthemera）等[2，5，19]。可能有两种原因：一是鸡形目和雀形目在系统演化上的差异所致；二是与鸡形目鸟类的孵化行为有关。雉类通常是雌性孵蛋，会有较长时间的离巢间隔，比如血雉，离巢时间可达6.6 h[29]。雀形目鸟类双亲孵化较多，比如火尾绿鹛，卵几乎不会暴露[30]；或者单亲孵化，雌鸟离巢时间也相对较短，比如火尾太阳鸟，平均离巢时间6.49 min[31]。鸡形目鸟类具有较小的孔径可能减缓因雌鸟长时间离巢导致的失温和水分散失。

3.3 筑巢位置和鸟卵显微结构

关于筑巢位置和鸟卵结构的关系，有研究指出地面营巢鸟的鸟卵易受微生物和病菌的侵袭，因此外表面有透明蛋白质的保护膜，而树上营巢的鸟类受微生物侵袭的机会稍少，外表面无透明蛋白质的保护膜；在壳膜纤维特征上，树上筑巢的鸟类比地面筑巢的鸟类纤维更致密[1，20]。本研究检验了筑巢位置的不同可能对鸟卵显微结构的影响，结果和前述研究存在差异：比如地面筑巢的淡背地鸫、蓝眉林鸲[32]，卵壳外表面上未见到保护膜，反而是在树上筑巢的火尾太阳鸟[31]，外表面上有保护膜；对于壳膜纤维密度，本研究中是地面营巢鸟类显著高于树上营巢鸟类，显得更为致密(表2)。筑巢位置和鸟卵显微结构的关系，还需作更多的研究。

致谢：感谢西南林业大学邵施苗、吴新然和高歌在卵壳的采集和数据分析中给予的帮助！