河南某斗鸡原种场禽白血病病毒感染状况监测

姬向波 ， 李新锋 ， 谢娜娜 ， 高小韩 ， 李婉涛 ， 向瑞平

(1.河南牧业经济学院实验研究中心 ， 河南 郑州 450046 ； 2.河南省畜禽遗传资源保护工程技术研究中心 ， 河南 郑州 450046)

禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)属于α反转录病毒群病毒属成员，通常根据血清中和试验、病毒宿主范围、囊膜糖蛋白的抗原结构等将其划分为A～J等10个亚群[1]。其中A亚群病毒是我国20世纪70年代鸡场常见的外源性病毒，J亚型致瘤性较强，90年代曾在我国白羽肉鸡和蛋用型鸡中感染蔓延，造成巨大经济损失[2-4]。经过连续多年的检疫和净化，我国白羽肉鸡和蛋用型鸡的ALV感染得到有效控制，但地方品种鸡群中ALV感染还很普遍，且呈一定的上升趋势，严重影响了地方鸡种种质资源的保护和利用[5-7]。

河南某斗鸡原种场拥有2 400多羽原种公鸡和12 000多羽原种母鸡，受该场委托调查其核心种鸡群的ALV感染状况，于2017年1月-2018年7月期间，分别采集该场核心种鸡群的雏鸡胎粪、泄殖腔棉拭子、血清、精液等样品进行检测，并对该场ALV分离株进行基因序列分析，明确了该场核心种群ALV的感染状况，为该场建立禽白血病净化措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 ALV-p27 ELISA检测试剂盒为荷兰Biochek公司产品，ALV-A/B、ALV-J亚型抗体ELISA检测试剂盒为美国IDEXX公司生产。DF-1细胞系由洛阳普莱柯生物有限公司惠赠。DMEM、胰酶和FBS为美国Gibco公司产品。PCR引物由生工Sangon Biotech(武汉)公司合成。Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒和DNA Marker为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

1.2 样品采集 按照参考文献[8-9]，分别6次采集某河南斗鸡原种场核心鸡群的雏鸡胎粪、泄殖腔棉拭子、公鸡精液等样品。样品基本信息见表1。每只鸡都戴有脚号，对号采集样品并进行编号，低温运输，及时检测。

表1 采集样品基本信息

1.3 ALV-A/B、J亚型抗体、p27抗原检测 采用ELISA方法对采集的样品进行检测。泄殖腔棉拭子和精液样品进行ALV-p27抗原检测，检测前反复冻融3次，离心取上清作为待检样品；血清样品进行ALV-A/B亚型、J亚型抗体检测。

1.4 病毒分离鉴定 按照参考文献[8]，将33份ALV-p27抗原阳性的鸡血浆0.5 mL分别接种于DF-1细胞，同时设正常DF-1细胞作为阴性对照。37 ℃孵育2h，吸弃血浆，加入含1% FBS的DMEM培养9 d。培养结束后经冻融处理，离心，取100 μL细胞上清液进行ALV-p27抗原ELISA检测，剩余细胞液用于提取ALV前病毒基因组。

1.5env基因的扩增、测序和同源性分析

1.5.1 引物设计与合成 参照A亚型RSA株、J亚型HPRS103株、E亚型JS14Z01株的env序列，设计可扩增3个ALV亚型env基因的通用引物，上游：5′-AGACCTACCGTTCTTACAG-3′； 下游：5′-CCCTCCC-TATGCAAAAGC-3′。预期扩增片段约2 000 bp。

1.5.2env基因的扩增和测序 取1.4制备的DF-1细胞，按照病毒DNA抽提试剂盒说明书，制备ALV前病毒DNA，以其为模板，PCR扩增env基因。扩增后采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，将与目的片段大小一致的PCR产物送至生工Sangon Biotech(武汉)有限公司，进行序列测定。

1.5.3 分离株env基因同源性分析 应用Lasergene 7.0软件，将该场分离的2株env基因核苷酸序列与参考毒株进行同源性比对，分析env基因的变异情况，采用MEGA 6.0构建ALV分离株env基因的遗传进化树。

2 结果

2.1 ALV-p27抗原、ALV- A/B、J亚型抗体检测结果 各样品检测结果见表2，由表可知，首次检测时，该场核心鸡群雏鸡胎粪ALV-p27抗原检出率为0，第二次检测对象为核心群开产母鸡，其ALV-p27抗原阳性率高达84.48%，ALV-A/B亚型抗体阳性率为17.14%，未检测到ALV- J亚型抗体。5个月后，该核心鸡群的ALV p27抗原阳性率升高至88.00%，且ALV-A/B亚型、J亚型抗体分别增至79.31%和24.14%。至2017年12月，核心群整体的ALV-p27抗原阳性率为78.10%，7个月后，阴性留种公鸡ALV-p27抗原阳性率又升至9.52%。由此可知，该场核心鸡群泄殖腔ALV-p27抗原阳性率在检测期内持续在较高范围内，但抗体阳性率在不同检测时间的差别较大。该结果说明该场核心群ALV-p27抗原阳性率很高，血清抗体以ALV-A/B亚型为主。

2.2 病毒分离鉴定 33份泄殖腔棉拭子ALV-p27阳性鸡血浆，接种DF-1细胞，培养9 d后，细胞培养液上清p27抗原ELISA检测阳性6份，占泄殖腔棉拭子ALV-p27阳性群的18.00%。分离到的6株ALV分别命名为HNDJ1701-HNDJ1706。

表2 ALV- p27抗原、ALV- A/B、J亚型抗体检测结果

2.3env基因的扩增和测序 以ALVenv基因通用引物对6份ALV前病毒env基因进行扩增，获得约2 000 bp的基因片段，与预期大小一致，结果见图1。

图1 env基因的PCR扩增结果

2.4env基因同源性分析 对分离自该场的2株分离株HNDJ1701和HNDJ1702的env基因进行了基因序列比对，该场2株分离株的同源性为90.8%， HNDJ1701与国内分离株ALV-A亚型SDAU09E2株、ALV-J亚型HPRS株的同源性分别为89.2%、56.4%，HNDJ1702与SDAU09E2株和HPRS株的同源性分别为89.2%和56.0%；HNDJ1701和HNDJ1702与国内近年来报道的ALV-K亚型JS11C1株同源性均在88.00%以上，与国内分离的ALV-E亚型JS14CZ01株和SD0501株的同源性分别为88.3%、88.3%和89.4%、90.5%(见图2)。

运用MEGA软件绘制的ALV遗传进化树结果见图3，可知该场HNDJ1701和HNDJ1702两个分离株在同一分支，且与2009年国内A亚型SDAU09E2H和K亚型JS11C1的所属分支较近，但与J亚型早期分离株HPRS103及国内近年来的J亚型分离株所属分支亲缘距离较远。

3 讨论

与发达国家相比，我国地方品种鸡的抗病育种工作起步较晚，缺乏规模化养殖和规范的疫病监控措施[10]。近年来，按照《我国中长期动物疫病防治规划(2010-2020年)》要求，许多地方品种鸡规模化养殖场开始着手进行相关疫病的检疫和净化工作。目前，禽白血病净化过程中常用的ALV病毒ELISA检测方法，可检测泄殖腔棉拭子、胎粪、血清和蛋清等样品中的ALV p27抗原含量，操作简单、快速，其中以泄殖腔样品的采集最为简便、且检出率较高[11]。监测结果显示，该核心鸡群生产的第1批雏鸡胎粪ALV-p27抗原阳性率为0，但成年鸡的ALV-p27抗原阳性率高达80%以上。导致该结果的原因有：(1)雏鸡胎粪样品本身ALV-p27抗原的检出率低，且抽检样品数量太少，不能反映核心群ALV感染状况；(2)虽然2次随机抽检的阳性鸡已及时淘汰，但由于阳性率高，而抽检数量少，未淘汰所有阳性鸡；(3)种公鸡血浆分离到外源ALV病毒，可能通过人工授精水平传播导致ALV感染率高。

考虑到该场品种选育对核心种群数量的要求，不能简单采取淘汰泄殖腔棉拭子ALV-p27阳性鸡的净化方法。从核心群ALV-p27抗原阳性鸡群随机采集33份血浆，进行病毒分离培养和鉴定。结果表明，外源性ALV分离率在泄殖腔棉拭子ALV-p27阳性群体中占比为18%。该结果与前人的研究较为一致，即鸡场在实施ALV净化的初期不应采用以泄殖腔ALV-p27抗原阳性作为淘汰鸡只的标准，因为在实际生产中发现，临床健康鸡群的泄殖腔ALV-p27抗原阳性最高可达30%，说明存在较高的假阳性[12]。因此，该场在ALV净化初期，应采血鉴定鸡只是否感染外源性ALV作为淘汰鸡只的标准，待扩群数量可满足育种需求时，再采集雏鸡胎粪、血清等样品进行检测，并提高净化标准。

研究显示，env基因是ALV致肿瘤的关键性基因，随病毒适应宿主而发生进化时最易发生变异，近年来在净化选择压力下，新分离ALV毒株env基因与早期分离株的同源性差异逐渐变大[13]。本研究中，随机选取的2株分离株env基因同源性为90.5%，通过与国内近年来各亚型分离株的序列比对表明，其在分支上基本归属于ALV-A亚型，与J亚型亲缘关系较远，说明该场核心鸡群存在一定的外源性ALV感染，且以A亚型为主。目前，未观察到该核心鸡群有明显的肿瘤性疾病，这基本符合ALV-A亚型感染的临床表现，如生长缓慢、死亡率较高、产蛋量、孵化率和出雏率等生产性能低下[14]。该结果与目前我国地方品种鸡群中的ALV流行趋势较为一致[15-16]，也与该场目前未引进外源品种进行杂交的实际情况相符。随着地方品种鸡养殖规模的扩大和鸡群流动性的增加，ALV-A在我国地方品种鸡群中的流行传播日趋严重，对地方品种资源保护造成较大威胁，应尽快采取措施进行ALV的检测和净化。

图2 分离株与不同亚型ALV env基因核苷酸同源性比对

图3 基于env基因的ALV核苷酸序列进化树