马蹄黄总黄酮抗炎 镇痛和止血作用研究

李 玲 , 李宇涵 , 郭思银 , 代 璐 , 冯皓媛 , 陈朝喜

(西南民族大学生命科学与技术学院 , 四川 成都 610041)

马蹄黄(Spenceria ramalana Trimen)属蔷薇科马蹄黄属多年生草本，主要产于四川、云南、西藏等省份和地区，常生长在海拔3 000～5 000 m的高山草原石灰岩山坡。据《中华人民共和国药典》记载，马蹄黄味苦、性寒，归脾、胃、大肠、肝和心包经[1]；其根可入药，具有解毒消炎、收敛止血、止泻和止痢等作用[2]。马蹄黄是我国藏族传统民间用药，是我国特有的植物，但目前对该药的研究较少，Lee 等人研究马蹄黄原花青素成分对体内高聚糖终产物形成和体内幼虫斑马鱼的玻璃体-视网膜血管扩张的影响[3]，然而并未深入研究其药理学作用。近年来，植物药以其天然低毒的特点备受青睐，而黄酮类化合物以其广泛的药理学作用尤为引人瞩目[4]。相关研究表明，植物药物中黄酮类化合物在降血糖[5-6]、降血压[7-9]、抗肿瘤[10-12]等方面具有良好功效。研究初步证实马蹄黄含有黄酮类化合物，对其抗炎、镇痛和止血作用进行探讨，以期为其在兽医临床应用提供更广泛的用药选择，并为其药用价值深入研究及开发利用奠定基础。

1 材料

1.1 实验动物 ICR小鼠，体重在18～22 g之间，雌雄兼用，由成都达硕实验动物有限公司提供。

1.2 药物与试剂 马蹄黄采自四川省甘孜州色达县丹青药王神山，由西南民族大学陈朝喜副教授鉴定为蔷薇科马蹄黄属马蹄黄的全草；AB-8型大孔吸附树脂(郑州勤实科技有限公司)；三氯化铝、柠檬酸三钠(成都市科龙化工试剂厂)；冰醋酸(天津市致远化学试剂有限公司，分析纯，批号20180133)；二甲苯(西安化学试剂厂)；角叉莱胶(上海伊卡生物技术有限公司)；云南白药(云南白药集团股份有限公司，批号Z53020798)；阿司匹林(石药集团欧意药业有限公司，批号H20153035)；凝血酶原时间测试盒、凝血酶时间测试盒(南京建成生物工程研究所，批号20180514)；无水乙醇(成都金山化学试剂有限公司，批号20180314)。

1.3 仪器与设备 HC-10型多功能测厚仪(上海黄海药检仪器有限公司)；YLS-6B型智能热板仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)；D-37520高速离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；WFH-203B三用紫外分析仪(上海驰唐电子有限公司)；PL303电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；RE-3000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-DIII循环水真空泵、DLSB-10/20低温冷却液循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；LGJ-10真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 马蹄黄总黄酮提取 参考并改进文献[13]方法进行马蹄黄总黄酮提取，具体操作步骤如下：取干燥马蹄黄2 kg，粉碎后过40目药典筛，10 L 70%乙醇浸泡3 d，过滤，将其滤液减压浓缩至1 g/L，加等体积水，冷却，过滤，滤液与AB-8大孔树脂柱吸附24 h 后，依次用水、10%乙醇、30%乙醇、70%乙醇洗脱，浓缩各个梯度洗脱液，经薄层检测(展开剂∶甲醇∶乙酸乙酯∶水=3∶0.8∶0.4)，喷雾1%三氯化铝乙醇溶液。

2.2 马蹄黄总黄酮急性毒性试验 参考文献[14]方法进行：随机将ICR小鼠分为4组，每组4只，禁食16 h后分别灌胃给予500、1 000、5 000 mg/kg·bw马蹄黄总黄酮，空白对照组给予小鼠0.4 mL/20 g·bw的蒸馏水，自由饮食、饮水，观察48 h。

2.3 马蹄黄总黄酮的抗炎试验

2.3.1 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 取ICR小鼠40只，雌雄兼用，分为5组，分别灌胃给予高(800 mg/kg·bw)、中(400 mg/kg·bw)、低(200 mg/kg·bw)剂量的马蹄黄总黄酮提取物，阳性和阴性对照组分别给药阿司匹林(50 mg/kg·bw)和等量生理盐水，1次/d，连续7 d。末次给药前用测厚仪测量每只小鼠右耳厚度作为正常值，末次给药后0.5 h，在每只小鼠右耳背涂20 μL二甲苯，1 h后测量每只小鼠右耳的厚度。致炎前后的厚度差即为肿胀值，肿胀抑制率= (对照组肿胀值-给药组肿胀值)/对照组肿胀值×100%，试验数据用SPSS软件进行单因素方差分析，下同。

2.3.2 对角叉莱胶致小鼠足跖肿胀的影响 参考文献[15]，按照“2.3.1”项的分组和给药方法，以云南白药(50 mg/kg·bw)为阳性对照组。末次给药后30 min，于每只小鼠右后肢足跖部皮下注射1%角叉莱胶50 μL/只，3 h后颈椎脱臼处死小鼠，于踝关节处剪下左右后肢称重，以两肢重量之差作为足跖肿胀度。

2.4 马蹄黄总黄酮的镇痛试验

2.4.1 对小鼠热板法镇痛作用的影响 参考文献[16]，40只雌性ICR小鼠按照“2.3.1”项的分组和给药方法，于给药前将每只小鼠放在智能热板仪上，温度控制在(55±0.5)℃，记录小鼠自放置热板到出现舔后足所需时间作为该鼠的痛域值。于末次给药15 min，30 min，60 min后分别记录每只小鼠的痛阈值。若小鼠在热板上60 s无舔后足行为则立即取出，以免烫伤小鼠，其痛阈值按60 s计算。

2.4.2 对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 参考文献[16]，按照“2.3.1”项的分组和给药方法，于末次给药2 h后向每只小鼠腹腔内注射0.8%醋酸溶液0.1 mL/10 g·bw，观察小鼠15 min内出现扭体反应(腹部内凹，躯干与后腿伸展、臀部高起、蠕行)次数，计算镇痛率。镇痛率=(空白对照组平均扭体反应次数-给药组平均扭体反应次数)/对照组平均扭体反应次数。

2.5 马蹄黄总黄酮的止血试验

2.5.1 对小鼠断尾出血时间的影响 参考文献[17]，按照“2.3.1”项的分组和给药方法，以云南白药(50 mg/kg·bw)为阳性组。于末次给药0.5 h后，采用断尾法测定小鼠止血时间。将小鼠固定，用利剪将小鼠尾尖0.5 cm处剪断，待血液自然流出后，开始计时，每隔30 s用滤纸吸去血滴，直至滤纸吸时无血为止，停止计时，此时间即为出血时间。

2.5.2 对血浆凝血酶时间(TT)的影响 参考文献[17]，按照“2.3.1”项的分组和给药方法，以云南白药(50 mg/kg·bw)为阳性对照组。每只小鼠断头采血0.45 mL，加入装有0.05 mL 3.8%柠檬酸三钠的离心管中，以3 000 r/min离心15 min，收集血浆。取血浆100 μL于离心管中，37 ℃水浴内孵育3 min后，加入预热至37 ℃的TT试剂100 μL，立即混匀，开始记时，每隔2 s倾斜离心管，直至试管液面不再流动为止，停止计时。此时间即为凝血酶时间。

2.5.3 对血浆凝血酶原时间(PT)的影响 参考文献[17]，取“2.5.2”项中的血浆50 μL于离心管中，37 ℃水浴内孵育3 min后，加入预热至37 ℃的PT试剂100 μL，立即混匀，开始记时，每隔2 s倾斜离心管1次，直至试管液面不再流动为止，停止计时。此时间即为血浆凝血酶原时间。

3 结果

3.1 马蹄黄总黄酮的提取纯化及其急性毒性测定 薄层层析结果表明，30%和70%乙醇洗脱液在365 nm紫外灯下显亮黄色荧光，表明马蹄黄总黄酮富集在30%和70%乙醇洗脱液中，故合并这两部分，浓缩、干燥后得到浅黄色总黄酮粉末。

急性毒性试验结果显示，给予5 000 mg/kg·bw马蹄黄总黄酮时，各试验组小鼠均未出现正常行为的改变，表明本方法提取纯化的总黄酮安全[14]。

3.2 马蹄黄总黄酮抗炎作用

3.2.1 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 试验结果见表1，从中可以看出：各剂量组的马蹄黄总黄酮均能抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀且具有剂量依赖效应，但只有高剂量组和阳性组与空白对照组比较有差异显著性，且高剂量组的抑制作用略差于阿司匹林阳性对照组。

表1 马蹄黄总黄酮对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 (x±SD)

3.2.2 对角叉莱胶致小鼠足跖肿胀的影响 试验结果表明，马蹄黄总黄酮低、中、高3个剂量组对角叉莱胶致小鼠足跖肿胀均有明显的抑制作用，且中、高剂量组的抑制率优于阳性组，其对小鼠足跖肿胀抑制率分别为8.40%、31.77%、44.14%，具有明显的剂量依赖效应，剂量越大，作用越强(表2)。

表2 马蹄黄总黄酮对角叉莱胶致小鼠足跖肿胀的影响 (x±SD)

3.3 马蹄黄总黄酮的镇痛作用

3.3.1 对小鼠热板法镇痛作用的影响 与空白对照组比较，马蹄黄总黄酮3个剂量组均能延长小鼠舔后足所需的时间，阳性对照组在30 min、60 min处的痛阈值具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，其中剂量组在30 min、60 min处的痛阈值具有显著差异性(P<0.05)，其高剂量组在30 min、60 min处的痛阈值具有极显著差异性(P<0.01)，且在30 min处痛阈值达到巅峰，明显优于阳性对照组(阿司匹林组)，提示马蹄黄总黄酮(全身给药)具有一定的镇痛作用(表3)。

3.3.2 对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 与空白对照组比较，马蹄黄总黄酮各个剂量组均能减少小鼠扭体反应次数，其中阳性(阿司匹林组)和高剂量组差异显著(P<0.05)，镇痛率分别为37.54%、28.04%。提示马蹄黄总黄酮(全身给药)具有一定的镇痛作用，且具有明显的剂量依赖效应，剂量越大，作用越强(表4)。

表3 马蹄黄总黄酮对小鼠热板法镇痛作用的影响 (x±SD)

表4 马蹄黄总黄酮对醋酸所致小鼠扭体反应的影响 (x±SD)

3.4 马蹄黄总黄酮的止血作用

3.4.1 对小鼠断尾出血时间的影响 与空白对照组比较，马蹄黄总黄酮各个剂量组均可缩短小鼠出血时间，但低剂量组作用不明显(P>0.05)，而中、高剂量组效果显著(P<0.05)，且高剂量组略优于阳性组，提示马蹄黄总黄酮具有一定的止血作用(表5)。

3.4.2 对血浆凝血酶时间(TT)的影响 与空白对照组比较，马蹄黄总黄酮中、高剂量组可使凝血酶时间缩短，且高剂量组优于阳性组，而低剂量组却未能减少凝血酶时间。因此，马蹄黄总黄酮对血浆凝血酶时间(TT)的影响取决于剂量的大小，剂量越大，作用越强(表5)。

3.4.3 对血浆凝血酶原时间(PT)的影响 试验结果表明，与空白对照组比较，阳性组和马蹄黄总黄酮低、中、高剂量组均可显著缩短凝血酶原时间(P<0.05)，其中高剂量组效果极为显著(P<0.01)，且明显优于阳性组(表5)。

表5 马蹄黄总黄酮对小鼠断尾出血时间、血浆凝血酶时间(TT)及血浆凝血酶原时间(PT)的影响 (x±SD)

4 讨论

黄酮类化合物是植物在长期的自然选择中产生的一些次级代谢产物[18]。本试验采用70%乙醇浸提，大孔树脂纯化方法得到总黄酮，证实了马蹄黄含有黄酮类化合物，但是并未对马蹄黄总黄酮最佳提取条件(如温度、料液比、提取次数和时间等)进行分析，对马蹄黄总黄酮的化学成分组成及结构还需要进一步研究。

截至目前，关于马蹄黄鲜有报道且缺少其药理作用研究资料。因此，本试验对马蹄黄总黄酮抗炎、镇痛、止血作用进行初步探讨。通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验、角叉莱胶致小鼠足跖肿胀试验建立动物急性非特异炎症模型[19]。试验结果表明，马蹄黄总黄酮能抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀以及角叉莱胶致小鼠足跖肿胀且高剂量组效果显著，对耳肿抑制率为57.89%，略高于余行报道的大叶紫珠高剂量总黄酮对二甲苯所致小鼠耳肿抑制率(49.35%)[20]。此外，本试验结果表明，马蹄黄总黄酮对急性炎症具有明显的抑制作用且具有一定的剂量依赖效应，为临床应用马蹄黄总黄酮治疗急性非特异性炎症等疾病提供了试验资料。小鼠热板法和醋酸扭体模型是药理试验检测镇痛药物药效最常用的方法，而此次镇痛试验结果显示，马蹄黄总黄酮3个剂量组均能延长小鼠舔舐后足所需的时间，提高痛阈值以及减少小鼠扭体反应次数并呈现浓度依赖效应。马蹄黄总黄酮高剂量组在30 min处痛阈值达到峰值(44.55 s)，其扭体镇痛率为28.04%，高于刘涛报道的沙地柏总黄酮高剂量组在60 min处的痛阈值的峰值(29.28 s)[21]，但低于陈素报道的龙血竭总黄酮高剂量组的扭体镇痛率(37.93%)[22]，两者可能由于给药剂量、给药时间的不同以及小鼠、植物本身存在差异而导致结果不同。抗炎和镇痛试验结果表明，它能有效缓解由化学或物理刺激引起的诸多炎性症状，并有助于提高痛阈和缓解致痛因素所带来的疼痛感且效果显著。在止血试验中，通过测定小鼠断尾出血时间以及对PT、TT时间的影响来判定马蹄黄总黄酮的止血作用。试验结果表明，马蹄黄总黄酮低、中、高剂量组均可缩短小鼠出血时间和PT、TT时间，其中中、高剂量组可显著缩短出血时间和PT时间，但对TT时间的影响不明显，推测其可能原因与TT试剂未预热至37 ℃有关，从而影响了本试验结果。其马蹄黄总黄酮高剂量组的小鼠断尾法出血时间(9.47 min)略低于封烨报道的紫地榆提取物高剂量组的出血时间(13.67 min)，且效果略优于阳性(云南白药组)，提示马蹄黄总黄酮具有一定的止血作用且呈剂量依赖效应。

综上所述，马蹄黄总黄酮具有一定的抗炎、镇痛、止血作用，但其抗炎、镇痛、止血机制尚不明确，还需做进一步的研究和探讨。