共振瑞利散射法测定透明质酸钠

冯玲

摘要：本实验研究了透明质酸钠溶液和糜蛋白酶溶液相互作用的共振瑞利散射光谱，其最大散射峰为300nm，RRS的强度在一定浓度范围内与透明质酸钠溶液浓度呈良好的线性关系，本文同时讨论了实验适宜的反应条件以及共存物质对测定结果的影响，结果显示该方法具有较好的灵敏度，且有较好选择性，从而建立一种测定透明质酸钠的新方法。该方法测定滴眼液中透明质酸钠的含量，效果较好。

关键词：糜蛋白酶；共振瑞利散射；透明质酸钠

透明质酸钠（Sodium hyaluronate，以下简称SH）可从鸡冠中提取或通过乳酸球菌发酵获得，SH是一种白色粉末状固体，有时也呈纤维状，具有较好的保湿性，能溶于水，不溶于乙醚、丙酮和乙醇等有机溶剂，无臭味，干燥时，氮含量为2.8%～4.0%，葡糖醛酸含量为37.0%～51.0%。是一种链状的天然高分子多糖类物质，结构式如下：

以前在测定透明质酸钠的方法上都有各自的优点和不足，本实验拟采用共振瑞利散射法对透明质酸进行测定，来建立一种更为高效、准确的检测方法。共振瑞利散射有如下的优点：①对稀溶液可进行测定，且灵敏度较高；②可操作性强，同时对RRS光谱的特征亦可进行研究。因其有较高的信号水平，可采用普通荧光光度计的普通光源作为发射光源，使普通光源通过单色器，形成波长连续的入射光，再经由普通荧光分光光度计同步扫描即可得到清晰完整的RRS光谱。整个实验过程中使用普通的荧光分光光度计即可得到测定物质的RRS光谱，由于使用仪器的廉价，对该技术的普及使用也更加容易。

1 实验部分

1.1 实验仪器

日立F-2700型荧光分光光度计， 测定参数：狭缝5 nm；PHS-3C型精密PH计，校正溶液PH值。

1.2 实验试剂

配制0.4 mg/mL的透明质酸钠溶液。糜蛋白酶溶液：采用100 μg/mL的样品。BR缓冲溶液：将0.04 mol/L H3PO4，H3BO3和CH3COOH混合一定比例的0.2 mol/L NaOH溶液，得到不同PH值的BR缓冲溶液，通过酸度计得出其PH值。该实验使用的其余试剂浓度均达到分析纯标准，使用二次蒸馏水作为实验用水。

1.3 实验方法

将PH=3.3的BR缓冲溶液1.0 mL、Chy溶液0.6 mL以及一定量的SH标准溶液加入10 mL的比色管中混合均匀，稀释至刻度后再摇匀。静置10 min后，用荧光分光光度计进行同步扫描（λex=λem）同时记录以各自最大散射波长处测定样品的共振瑞利散射光谱IRRS和试剂空白散射强度的共振瑞利散射光谱I0RRS，?IRRS=IRRS-I0RRS。

2 结果与讨论

光谱特征

RRS光谱

以△λ=0 nm分别扫描SH溶液、Chy溶液以及SH-Chy体系溶液，得RRS光谱图。通过观察并分析光谱图可得：单独的SH溶液和Chy溶液其共振瑞利散射强度都很微弱，但当两者混合后，相互作用形成复合物时，共振瑞利散射强度明显增强，并在300 nm处产生一个清晰的散射峰。

通过研究不同浓度的SH溶液对Chy-SH体系RRS强度的影响，得到RRS光谱。从光谱图可知：当SH concentration的浓度在0～1.0 μg/mL范围内递增时，Chy-SH体系的RRS强度在300 nm处依次增强，呈良好的线性关系。

适宜的反应条件

（1）酸度的影响。分别试验了BR、HAc-NaAc等缓冲溶液对SH-Chy体系的影响，结果显示BR缓沖液对体系的测定最佳，进一步优化BR缓冲液在不同PH值对该体系的影响。通过进行数据分析可知，当溶液PH在2.8～4.8时该体系的共振瑞利散射光谱的差值最大，本实验选取PH=3.3的BR缓冲液1.0 mL进行实验。

（2）糜蛋白酶浓度的影响。从结果可以看出Chy与SH反应在Chy浓度5.0～15 μg/mL时，Chy-SH体系的散射强度达到最大，以下实验选用Chy浓度为6.0 μg/mL。

反应时间及稳定性

在上述的实验条件和室温下，考察了时间及该体系的稳定性，实验结果显示10 min内Chy溶液与SH溶液可完全反应，且在1h内其DIRRS的值较为稳定，所以当实验反应10 min后再进行测定。

标准曲线

选择最佳实验反应条件，分别将不同浓度的SH溶液与Chy溶液进行混合，并在其最大波长处测定RRS的强度，通过使用该体系散射增强后的ΔIRRS值进行绘制透明质酸钠浓度标准曲线。实验结果表明该方法对透明质酸钠的测定灵敏度较高、检出限较好，其检出限为4.33 ng/mL。

方法的选择性

实验研究了共存金属离子、无机酸根、糖类、氨基酸等对该体系的影响。实验结果表明以上物质在一定浓度范围内对该体系不造成影响，该方法具有良好的选择性。

3 分析应用

在10 mL比色管中加入稀释后浓度为1.0 mL（0.01 mg/mL）的透明质酸钠滴眼液，在最佳条件下对其进行测定，再向其中加入标准的透明质酸钠溶液来检验该方法的回收率。分析实验数据从而得出该方法具有较好的准确度和精密度。

4 结论

本实验考察了透明质酸钠溶液与糜蛋白酶溶液混合体系的共振瑞利散射光谱，建立了一种测定透明质酸钠的新方法，该方法应用于滴眼液中透明质酸钠含量的测定结果较好，令人满意。

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（作者单位：四川省南充市高坪第七小学江东校区）