利用SSR分子标记技术快速鉴定杂交油菜天禾油10号纯度

朱哲逸 张彩娟 徐青青 朱宗河

摘  要：以甘蓝型油菜天禾油10号及其父母本为材料，利用SSR分子标记方法对天禾油10号杂交制种待测样品进行了鉴定分析。结果表明，利用引物CB10036、CN48鉴定待测样品144棵单株，纯度为67.08%，同批次待测样大田种植鉴定纯度为70.2%，两种方法鉴定结果基本一致，说明引物CB10036、CN48可用于天禾油10号的室内纯度快速鉴定。

关键词：油菜;SSR分子标记技术;天禾油10;纯度

中图分类号 S565.4文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）04-0016-03

中国是油菜生产大国，种植总面积和总产均占世界30%左右[1]。甘蓝型杂交油菜超亲优势明显，达20%～30%[2]，其群体纯度即杂种群体的非杂种植株的多少，是影响群体产量的重要因素之一[3]。为降低杂交油菜制种风险，需要快速、准确、有效地鉴定杂交油菜品种的纯度[4]。杂交油菜品种传统的纯度鉴定方法主要是大田种植鉴定[5]，但完全依据大田种植鉴定需要异地种植，周期较长[6]。采用同工酶技术鉴定虽然鉴定时间较短，但难以区分亲缘关系较近的杂交种[7]。由于SSR标记鉴定技术能体现出同一位点在不同个体之间的多态性，并且数量丰富，扩增稳定，扩增谱带少，易于检测，具有共显性、重复好、多态性丰富以及简单快捷易于掌握等特点，近年来已大量用于杂交油菜的纯度鉴定中[8-19]。本研究探索利用SSR分子标记技术对国审杂交油菜品种天禾油10号大田生产的杂交种纯度进行鉴定，辅助田间种植鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料 供试材料为国审油菜品种天禾油10号及其亲本不育系5C650和恢复系R161。亲本种子及天禾油10号杂交种由天禾科技集团股份有限公司提供。

1.1.1 取样 杂交种天禾油10号纯度待测样取自安徽和县制种田，制种田于2016年9月播种，收获前在代表性制种田采取“Z”形选取样株。各取样株主轴、一次分枝、二次分枝角果数按1∶1∶1取样，每株取12个角果，共取1000个角果。取样角果45℃烘箱烘干后脱粒后，所取纯度待测样种子混匀后一分为二，1份于2017年5月15日带到青海进行种植鉴定，1份发芽后进行室内SSR纯度鉴定。室内鉴定于2017年12月至2018年2月在安徽农业大学生物科技楼进行。

1.1.2 引物来源 SSR引物和DNA聚合酶购自上海生工，引物序列源于中华人民共和国农业行业标准《甘蓝型油菜品种鉴定技术标准SSR标记法》（NY/T 2468-2013）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 在12cm×12cm×6cm的发芽盒中放2层发芽纸，喷蒸馏水充分湿润发芽纸，在发芽纸上均匀点上亲本及杂交种，光照发芽箱室温下发芽7d。选取150株杂交种幼苗，分单株提取DNA，各取5个父、母本单株的幼嫩子叶混合磨样后提取DNA。DNA提取方法参照陆光远等的CTAB法[20]。

1.2.2 扩增反应 将-20℃保存的杂交种及亲本DNA稀释至30ng·μL-1进行PCR扩增。10μLPCR反应体系为：DNA1μL，dNTPs0.1μL，含Mg2+缓冲液1μL，Taq酶0.1μL，上下游引物各0.5μL，加超纯水至10μL。体系配置完成后加入甘油封口，PCR按如下程序进行：94℃、5min;1个循环;94℃、1min;60℃、30s，每循环降0.5℃;72℃、45s，以上梯度进行10个循环;94℃、1min;55℃、30s;72℃、45s以上梯度进行30个循环;最后72℃、8min;4℃保存。

1.2.3 扩增产物检测 扩增产物4℃冷藏备用。SSR扩增产物加1/2体积的变性上样缓冲液，95℃变性5min后立即冷却，然后在8%的变性聚丙烯酰胺凝胶上85W恒功率电泳1.5h。电泳结束后，变性凝胶用10%冰醋酸溶液固定、水洗，并用0.1%的硝酸银溶液染色，1.5%NaOH溶液显色，再用10%冰醋酸溶液终止显影，漂洗并风干，拍照并记录扩增条带结果。

1.2.4 SSR纯度鉴定 按照种子纯度计算公式P（%）=C/T×100（P为纯度，C为同时具有双亲特征谱带的样本数，T为待测样品植株总数。统计并计算杂效种纯度，比较SSR纯度鉴定与大田种植鉴定的结果，确定SSR纯度鉴定的有效性

1.2.5 田间种植鉴定 田间种植鉴定于2017年5—8月在青海省海东市平安区安徽省北繁中心试验地进行。鉴定样播20行/区，2m/行，每行播100粒种子，按同样密度及播量播种少量标准杂交种作对照，生产期间不间苗。在盛花期，调查不育株及与标准杂交株有明显区别的异型株。田间鉴定纯度（%）=（待测样调查总株数一不育株数-异型株）×100/待测样调查总株数。

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选 使用《甘蓝型油菜品种鉴定技术标准SSR标记法》（NY/T 2468-2013）中47对SSR引物对天禾油10号标准杂交种及其亲本进行PCR扩增，筛选出2对在标准雜交种的父母间差异明显并在杂交种呈现出清晰双亲互补特征条带的引物（见表1），用于天禾油10号杂交种的纯度快速检测。

2.2 SSR鉴定结果 根据待测杂交种及亲本的扩增结果，统计同时具有双亲特征谱带的样本株数。引物CB10036扩增的单株有效株数为143株，其中同时具有双亲特征谱带的真杂种样本株数为91株;根据纯度计算公式，计算出天禾油10号杂交种的纯度为63.64%，引物CN48扩增的单株有效株数为142株，其中同时具有双亲特征谱带的真杂种样本株数为100株;计算天禾油10号杂交种的纯度为70.42%。2对引物鉴定天禾油10号的平均纯度为67.08%。

2.3 田间种植鉴定结果 大田调查945株，其中杂交种有663株，母本自交种282株，根据纯度计算公式计算，杂交种的纯度为70.2%，假杂种全部为母本自交种子。

3 讨论与结论

为简化杂交油菜SSR纯度室內鉴定的程序，本研究未进行SSR引物筛选，而是从油菜SSR核心引物中随机选择了CB10036和CN48这2对引物对天禾油10号的父母本及杂交种进扩增，结果表明，2对随机选择引物都能准确区分出待测样中的真杂种及混杂的父母本，2对引物扩增结果都具有很好的一致性，且2对引物鉴定天禾油10号待测样纯度鉴定结果也相近。说明SSR标记有稳定的共显性，可以用来鉴定甘蓝型油菜的杂交种。

通过对天禾油10号纯度的室内SSR鉴定与田间种植鉴定的结果进行比较可知，2种方法用于天禾油10号的纯度鉴定结果基本一致，都可以用于天禾油10号的纯度鉴定。室内SSR鉴定能将待测样真杂种中混杂的父本、母本、异品种通过扩增条带与真杂种区别开来，而田间种植鉴定，通常只鉴定待测样中的母本株，因此同一待测样纯度室内SSR鉴定结果往往略低于田间种植鉴定。

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（责编：张宏民）