miR-7与肝细胞性肝癌EMT及临床病理特征之间的相关性研究

张传海，张鹤松，桂 阳，郭凤林，马金良，余继海

肝癌以发病率高、转移性强、病死率高成为严重威胁人类健康的重要疾病，2012年的调查显示每年全世界约有76万人死于肝癌，占癌症总死亡人数的9.1%，在恶性肿瘤中居于第二位，而我国肝癌的发病率和死亡率居于第四位。肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝癌最常见的临床类型，约占肝癌的80%[1-3]。课题组前期的体外实验[4]证实miR-7可通过结合表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)3′-UTR非编码区(untranslated region，UTR)，抑制EGFR信号通路活性，进而抑制人高转移肝癌细胞株(highly invasive human hepatocellular carcinoma cell，MHCC-97H上皮间质化转变(epithelial mesenchymal transition，EMT)，降低MHCC-97H的侵袭、迁移能力[4]。该研究拟通过比较分析microRNA(miR)-7在肝癌组织中的表达及其与HCC病理学特性、EMT之间的关系，进一步探讨其在HCC中的重要作用，为深入探讨HCC特异性、敏感性早期诊断指标及转移的分子机制、临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1材料30组HCC组织标本取自2016年1月～2017年6月安徽省立医院肝胆外科手术切除的HCC组织及癌旁组织(距离癌组织5 cm以上)。所有组织标本经术后病理检测证实为HCC，术前均未接受抗肿瘤治疗，并且与患者或家属进行了充分沟通并签署了实验知情同意书。RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；Real-time PCR试剂购自日本TaKaRa公司；Real-time PCR引物购自美国Invitrogen公司；GAPDH、E-cadherin、N-cadherin抗体购自美国Santa Cruz公司；ABI 7500 Real-time PCR仪购自美国ABI公司。

1.2方法

1.2.1Real-time PCR 参照RNA提取试剂盒说明书提取组织总RNA。以总RNA为模板，参照反转录试剂盒说明书合成cDNA第一链。以cDNA为模板，使用ABI 7500 Real-time PCR仪检测U6、GAPDH、miR-7、E-cadherin和N-cadherin的表达。其中，miR-7和U6的上游引物序列分别为：5′-TGGAAGACTAGTGATT-3′和5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物为通用引物；E-cadherin上游引物：5′-TCGCTTACACCATCCTCAGC-3′，下游引物：5′-GGAAACTCTCTCGGTCCAGC-3′；N-cadherin上游引物：5′-AACAGCAACGACGGGTTAGT-3′，下游引物：5′-CAGACACGGTTGCAGTTGAC-3′；GAPDH上游引物：5′- GCCGCATCTTCTTTTGCGTC -3′，下游引物：5′- TACGACCAAATCCGTTGACTCC -3′。PCR反应程序为：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。分析miR-7以U6为内参，分析E-cadherin和N-cadherin则以GAPDH作为内参。

1.2.2Western blot 应用RIPA(强)细胞裂解液进行冰上匀浆操作，提取组织总蛋白，BCA法定量后，按50 μg/孔的量加样、电泳、转膜。各蛋白的转膜条件分别为GADPH：120 mA，2 h；E-cadherin：150 mA，3 h；N-cadherin：150 mA，3 h；转膜结束后，应用浓度为5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，TBST洗膜 3 min。分别参考抗体说明书进行抗体稀释，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min。相应二抗室温孵育1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL发光、显影，以GAPDH为内参，分析各指标的相对表达量。

2 结果

2.1miR-7的表达情况与癌旁组织比较，癌组织中miR-7的表达水平显著降低，差异有统计学意义(F=1.753，P=0.000)。与非转移性癌组织比较，转移性癌组织中miR-7的表达亦明显降低，差异有统计学意义(F=1.600，P=0.047)，见图1。

2.2E-cadherin、N-cadherin的表达情况Real-time PCR和Western blot检测结果均表明，与癌旁组织比较，癌组织中E-cadherin mRNA和蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义(F=3.085，P=0.000；F=4.072，P=0.000)，而N-cadherin mRNA和蛋白表达均明显升高，差异有统计学意义(F=122.6，P=0.000；F=5.751，P=0.000)。见图2、3。

2.3miR-7的表达与E-cadherin、N-cadherin之间的关系相关性分析表明，miR-7在HCC组织中的表达与E-cadherin呈正相关性(r=0.426)，与N-cadherin呈负相关性(r=-0.182)。见图4。

2.4miR-7与HCC临床病理特征之间的相关性临床病理资料分析结果表明，miR-7在HCC中的表达与患者年龄、性别、HBV感染均无相关性(P>0.05)，与TNM分期、分化程度、血管浸润密切相关(P<0.05)。见表1。

3 讨论

miRs是一类具有调控功能的非编码RNA，可靶向作用mRNA而参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化的调控，在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的生物学功能，是近年来研究肿瘤发病分子机制的热点。其中，miR-1、miR-25、miR-206、miR-375等具有肿瘤特异性，有可能成为检测肿瘤的血清生物学的标志物[5-7]。研究[8-9]表明，miR-7具有抑癌基因特性，可抑制肺癌、结肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌等多种肿瘤的侵袭、迁移。Webster et al[10]研究证明，miR-7可通过调节EGFR信号途径而抑制肺癌、乳腺癌和胶质母细胞瘤等的发生发展。Wang et al[11]研究表明，miR-7可通过抑制癌基因电压依赖性阴离子通道1的表达而降低HCC的增殖及转移。同样，课题组前期实验研究[4]表明，miR-7可通过结合EGFR 3′-UTR，抑制EGFR信号通路活性，进而抑制MHCC-97H细胞EMT，降低MHCC-97H细胞侵袭、迁移能力。

图1 miR-7在不同组织中的差异性表达

表1 miR-7与HCC临床病理特征之间的相关性分析

图2 E-cadherin、N-cadherin mRNA在不同组织中的差异性表达分析与癌旁组织比较：**P<0.01

图3 E-cadherin、N-cadherin蛋白在不同组织中的差异性表达分析

图4 miR-7的表达与E-cadherin、N-cadherin分析

EMT是反映细胞侵袭、迁移能力的重要指标，抑制EMT可减弱肝癌的转移，从而提高肝癌的临床治疗效果，降低肝癌复发率。因此，本研究以miR-7与HCC EMT之间的关系为切入点，研究表明miR-7在HCC癌组织的表达水平显著低于癌旁组织(P<0.01)，并且miR-7在转移性HCC癌组织的表达水平显著低于非转移性HCC癌组织(P<0.01)，再次证实miR-7的异常表达与HCC的发生发展具有密切相关性，其具有作为诊断HCC潜在指标的可能性，检测miR-7的表达情况对HCC的临床诊断、治疗及预后判断有潜在的重要意义。

然而，由于miR-7作用途径的多样性、作用机制的复杂性，后期将通过进行更加深入广泛的研究，进一步阐述其在HCC中的生物学功能，以期为HCC的发病机制研究提供新思路。