土木香内生细菌的分离鉴定及抑菌活性检测

吾鲁木汗·那孜尔别克，玛依拉·吐尔地别克，恩特马克·布拉提白

(伊犁师范大学生物与地理科学学院，新疆 伊宁 835000)

植物内生菌(Plant Endophyte)是指生活在健康植物组织内部且不引起植物组织明显侵染及症状的一类菌，包括真菌、细菌和放线菌[1].内生菌与宿主植物长期协同进化.由于基因转移及对内化学环境的适应性，内生菌能够产生与宿主植物相同或相似的活性成分，因此药用植物内生细菌次生代谢产物的研究越来越受到国内外学者的关注[2].研究者们也从药用植物的内生细菌中发现了一些新颖的次生代谢产物，如由内生的丁香假单孢菌(Pseudomonassyringae)产生的脂肽类物质Pseudomycins，由禾本科植物内生的绿黄假单孢菌(Pseudomnasviridiflava)产生的结构新颖的脂肽类化合物Ecomycins，它们对新生隐球菌和白假丝酵母等人体病原真菌具有很强的抑菌活性，可被开发成新型抗生素[3-4].

土木香(InulaheleniumL.)是菊科旋覆花属的多年生草本植物，主要分布于河南、河北、浙江、四川、山西、陕西、甘肃及新疆等地.土木香具有健脾和胃、调气解郁、止痛安胎的功能，临床常用于治疗胸胁、脘腹胀痛、呕吐泻痢、胸胁挫伤、岔气作痛、胎动不安等[5].土木香中主要的化学成分是倍半萜内酯类，包括土木香内酯、异土木香内酯、土木香醇、土木香酸、二氢土木香内酯等，其中土木香内酯和异土木香内酯具有抑制肿瘤细胞、驱虫、抗菌、抑制平滑肌、降血糖和利胆等作用[6-13].但关于药用植物土木香的已有文献当中，未见有其内生细菌的研究报道，因此，笔者拟对土木香根、茎和叶部内生细菌进行分离并进行抑菌活性检测和鉴定，为寻找新的具有禽巴氏杆菌的活性代谢产物提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物与供试菌株 药用植物土木香于2017年6月下旬从伊犁尼勒克县唐布拉草原采集，带回实验室后经表面冲洗、消毒等处理后进行内生菌的分离.供试细菌大肠杆菌CGMCC1.1103、枯草芽孢杆菌CGMCC1.769、禽多杀性巴氏杆菌C48-3均由本实验室保存.

1.1.2 试剂与培养基 PCR试剂、DNA marker购自大连宝生物工程有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；牛肉膏蛋白胨培养基、蛋白胨培养基、明胶培养基、淀粉培养基、柠檬酸盐培养基、糖发酵培养基和葡萄糖蛋白胨培养基用于土木香内生细菌的分离和生理生化鉴定；TB(tryprtose broth)培养和DSA(dextrose starch agar)培养基均为美国Bacto公司产品，用于禽巴氏杆菌的培养.

1.2 方法

1.2.1 土木香内生菌的分离 首先将土木香根、茎和叶片切成0.5 cm的小片，无菌水冲洗3次；然后用Tween-20处理30 s，8%次氯酸钠溶液消毒5 min，无菌水冲洗3次；接着用75%乙醇浸泡5 min，无菌水冲洗3次；最后用无菌组织匀浆器研磨组织块，将组织匀浆液按10倍梯度稀释至10-1～10-3，分别吸取100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，每个梯度重复3次.同时，吸取样本处理时最后一次无菌水冲洗液各100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基做相应的对照培养.若培养后无细菌生长，则表明表面消毒彻底.37 ℃倒置培养24 h后，培养基中可见菌落形成.根据菌落形态差异挑取不同的内生细菌单菌落，接种于5 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基，37 ℃震荡培养24 h；然后将菌液接种于牛肉膏蛋白胨平板，37 ℃倒置培养24 h；取单菌落进行革兰氏染色，用显微镜观察菌体形态结构，经反复转接得到纯化菌株.

1.2.2 土木香内生细菌抑菌活性检测 拱试菌株的培养：将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种于5 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基，37 ℃培养18 h，然后用新鲜培养液将菌液稀释为1×105CFU/mL，取100 μL菌液涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上；将禽巴氏杆菌接种于5 mL的TB液体培养基，37 ℃培养18 h，然后用新鲜TB培养基将菌液稀释为1×105CFU/mL，取100 μL菌液接种于DSA固体培养基上.抑菌活性测定：采用滤纸片法测定内生细菌的抑菌活性，将土木香内生细菌接种于50 mL的牛肉膏蛋白胨培养基中，37 ℃振荡培养24 h，然后将发酵液9 000 r/min离心15 min，过滤除菌，接着将滤纸片置于供试菌的固体培养基上，点入15 μL发酵液，37 ℃静置培养24 h，观察并测定抑菌圈的直径.

1.2.3 土木香内生细菌的鉴定 参照文献[14]对具有抑菌活性的土木香内生细菌进行生理生化鉴定.用细菌基因组DNA提取试剂盒制备细菌的基因组DNA，并用通用引物F8(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R1492(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增.PCR产物由上海生工生物工程股份有限公司进行测序.序列相似性分析利用BLAST软件在线进行.从GenBank数据库获得相关种属的16S rRNA基因序列，建立系统发育树.用ClustalX1.83软件对序列进行排列，用邻接法(Neighbor-Joining method)计算进化距离，采用P-distances法和Kimura-2-prarmeter双参数法在用MEGA5.0软件中建立系统发育树，进化树分支的置信度采用Bootstrap法分析，重复次数为1 000.

2 结果与讨论

2.1 内生细菌的分离

采用组织分离法从土木香根、茎和叶片中共分离得到菌落和菌体形态特征不同的细菌32株，其中根部16株，颈部10株，叶片6株.表这明土木香根、茎和叶片组织中分离得到的内生细菌数量有一定的差异.

2.2 内生细菌的抑菌活性

采用滤纸片法从32株土木香内生细菌中筛选出10株具有抑菌活性的细菌.抑菌试验结果显示：菌株YIR-4对大肠杆菌的抑菌圈直径为12 mm，菌株YIR-3对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为13，11 mm，菌株YIR-5对枯草芽孢杆菌和禽巴氏杆菌的抑菌圈直径分别为16，9 mm，菌株YIR-6，YIR-7，YIR-8，YIR-9对大肠杆菌和禽巴氏杆菌的抑菌圈直径均为15 mm，菌株YIS-2对枯草芽孢杆菌和禽巴氏杆菌的抑菌圈直径分别为18，13 mm，菌株YIL-3对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和禽巴氏杆菌的抑菌圈直径分别为14，12，13 mm，菌株YIS-1对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和禽巴氏杆菌抑菌圈直径分别为19，17，20 mm(图1).表明在10株土木香内生细菌中菌株YIS-1对3种指示菌的抑菌作用最强.

3，4—无菌水对照组；(A)1，2—大肠杆菌CGMCC1.1103；(B)1，2—枯草芽孢杆菌CGMCC1.769；(C)1，2—禽巴氏杆菌C48-3.图1 土木香内生菌YIS-1发酵液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和禽巴氏杆菌的抑菌作用Fig. 1 Antibacterial Effect of Endophytic Yeast YIS-1 Fermentation Broth on Escherichia Coli, Bacillus Subtilis and Avian Pasteurella Multocida

2.3 内生细菌的生理生化特征

生理生化实验结果显示：菌株YIR-5，YIR-7，YIR-8，YIR-9均能利用葡萄糖、不能利用乳糖，甲基红试验阴性，V-P试验阳性，能分解柠檬酸盐，产生淀粉酶、不产生蛋白酶，属革兰氏阴性菌；菌株YIR-3，YIR-6均能利用葡萄糖和乳糖，甲基红试验、V-P试验阳性，能分解柠檬酸盐，产生淀粉酶和蛋白酶，属革兰氏阴性菌；菌株YIR-4能利用葡萄糖和乳糖，分解柠檬酸盐，甲基红试验阴性，V-P试验阳性，不产生淀粉酶和蛋白酶，属革兰氏阴性菌；菌株YIS-1，YIS-2，YIL-3均能利用葡萄糖和乳糖，V-P试验、甲基红试验阴性，产生淀粉酶、不产生蛋白酶，属革兰氏阳性菌.根据细菌的生理生化特征，初步将菌株YIR-5，YIR-7，YIR-8，YIR-9归属为假单胞菌属(Pseudomonas)，菌株YIR-3，YIR-6归属为沙雷菌属(Serratia)，菌株YIR-4归属为拉恩氏菌属(Rahnella)，菌株YIS-1，YIS-2，YIL-3归属为芽孢杆菌属(Bacillus).

2.4 细菌16S rRNA基因的PCR扩增

用通用引物F8和R1492R从10株土木香内生细菌基因组DNA中扩增出大小约为1.4 kb的DNA片段.结果如图2所示，与预期值相符.

M—标准DNA DL2000；1—PCR阴性对照；2～10—PCR扩增产物.图2 土木香内生细菌16 rRNA基因的PCR扩增Fig. 2 PCR Amplification of 16 rRNA Gene of Endophytic Bacteria from Inula Helenium

2.5 细菌16S rRNA基因的序列分析

16S rRNA基因的序列分析结果列于表1.由表1可知,10株具有抑菌活性的土木香内生细菌16S rRNA序列与在GenBank数据库中已报道相关菌株16S rRNA序列的相似度都在97%以上.

表1 土木香内生细菌16S rRNA序列的相似性

2.6 细菌16S rRNA序列的系统发育分析

结果如图3～5所示.

图3 土木香内生细菌与参考菌株16S rRNA序列的系统发育树1Fig. 3 Phylogenetic Tree-1 of Endophytic Bacteria from Inula Helenium L. and Reference Strain 16S rRNA Sequence

图4 土木香内生细菌与参考菌株16S rRNA序列的系统发育树2Fig. 4 Phylogenetic Tree-2 of Endophytic Bacteria from Inula Helenium L. and Reference Strain 16S rRNA Sequence

图5 土木香内生细菌与参考菌株16S rRNA序列的系统发育树3Fig. 5 Phylogenetic Tree-3 of Endophytic Bacteria from Inula Helenium L. and Reference Strain 16S rRNA Sequence

由图3可知:菌株YIR-5与假单胞菌属(Pseudomonus)的菌株G11和菌株RMP9系统发育关系最密切，但菌株YIGX-5不与这2株参考菌株中任何一个单独相聚，形成了一个独立亚分支，表明该菌株可能是一个潜在新种；菌株YIR-8和YIR-9与皱纹假单胞菌(Pseudomonascorrugata)155-HR9、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)LBUM770和BZ64H在同一个大分支，但菌株YIR-7，YIR-8，YIR-9不与4株参考菌株中任何一个单独相聚，形成了一个单独亚分支.因此，结合细菌生理生化特征，将菌株YIR-5，YIR-7，YIR-8，YIR-9鉴定为假单胞菌属菌种，其中菌株YIR-5和YIR-7可能是一个潜在新种.

由图4可知:菌株YIR-4与水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)KNOUC601聚在一个分支，菌株YIR-3与沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)B131聚在一个分支，菌株YIR-6与沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)BG18聚在一个大分支.因此，结合细菌生理生化特征，将菌株YIR-4鉴定为水生拉恩氏菌，菌株YIR-3和YIR-6鉴定为沙雷氏菌.

由图5可知:菌株YIS-1与薄壁芽胞杆菌(Bacillushalotolerans)B聚在一个分支，菌株YIS-2与蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)S43聚在一个分支，菌株YIL-3与Bacillussubtilisstrain Y4和Bacillusamyloliquefaciensstrain TB6及Bacillussubtilisstrain 2C-62归属在同一个大分支，但菌株YIL-3不与3株参考菌株中任何一个单独相聚，而形成了一个单独亚分支.因此，结合细菌生理生化特性，将菌株YIS-1和YIS-2分别鉴定为薄壁芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌，而菌株YIL-3可能是芽孢杆菌属的一个潜在新种.

3 结论

抑菌试验结果显示，有10株土木香内生细菌发酵液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和禽巴氏杆菌有不同程度的抑菌作用，其中：2株内生菌对3种指示菌具有较强的抑菌作用，7株内生菌对2种指示菌具有一定的抑菌作用，1株内生菌只对1种指示菌具有较强的抑菌作用；1株内生菌只能抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌的增殖，1株内生菌抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌的增殖，4株内生菌能抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌和禽巴氏杆菌的增殖，2株内生菌均能抑制革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌禽巴氏杆菌的增殖，2株菌均能抑制革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌、禽巴氏杆菌的增殖. 10株土木香内生细菌当中YIS-1菌株对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和禽巴氏杆菌的抑菌活性最为明显，具有重要的开发价值，可为寻找新的具有禽巴氏杆菌的活性代谢产物提供参考依据.