通过电激转化法选育耐高温型阿魏侧耳菌种

李学斌，高 蕾，关美芝，李 晓

1.乌鲁木齐高鑫博渊生物科技有限公司，乌鲁木齐 830031 2.乌鲁木齐市第十八小学，乌鲁木齐 830006 3.乌鲁木齐市公安局天山分局，乌鲁木齐 830002

阿魏侧耳（Pleurotus ferulae）因野生寄生或腐生在中药阿魏（Ferula sinkianensis）肥大的根茎部，而得俗名阿魏菇[1]。在我国主要分布在新疆。阿魏菇具有很高的食用价值和药用价值，子实体分化温度在0 ～15℃，生长温度6 ～18℃，新疆每年夏季6 月中旬到8 月底，由于气温较高，阿魏菇生长停滞。

电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激孔”（Electroporation），形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA 的摄取。自1979 年Zimmerann发明该法以来，经过多年的研究和改进，已广泛应用于动物、植物的遗传转化研究[2]。1991年，Royer JC等首先采用电激法把编码二氢乳清酸脱酶基因URA1导入同源的杨树菇营养缺陷型突变菌株中，获得正常表达的杨树菇[3]，接着双孢蘑菇、糙皮侧耳等也用该法进行遗传转化，获得转化子[4，5，6，7]。

采用电激转化法，将未带标记的平菇（伏夏200）糙皮侧耳总基因组DNA 通过电机转化导入阿魏菇原生质体，采用临界温度筛选转化子，获得了生长速度快、不需低温刺激仍能正常出菇的高温型阿魏菇新品种。本方法没有化学物质对原生质体的伤害，操作简单方便，遗传转化效率较高。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

糙皮侧耳(P.ostreatus）伏夏200 由新疆农业科学院提供。菌盖直径4～9 cm，菌盖边缘较圆整，出菇温度为0～32℃，转潮快，产量高，生物学转化率100%。

受体：新疆阿魏侧耳（K8，实验编号：NB）原生质体。

阿魏侧耳（P.ferulae）K8 为新疆的主栽品种，子实体丛生，侧耳状(直径 6～13 cm，厚1～6 cm)，白色，菌丝生长适宜温度为20～26 色，出菇（子实体生长）温度8～16 菇，转化率26%，由新疆农业科学院提供。

1.2 培养基及试剂

菌丝生长培养基: 20 g葡萄糖，10 g酵母粉，10 g蛋白胨，18 g琼脂。

PDA液体培养基

原生质体再生培养基：250 g 土豆，10 g 蛋白胨，3 g KH2PO4，0.3 g MgSO4·7H2O，205.4 g 蔗糖（0.6 mol/L ），去离子水1 L。

复苏培养基：称取蔗糖，加去离子水至终浓度为0.6 mol/L。

栽培料：62.79%棉籽壳、18%玉米粉、10%麸皮、6%油渣、1%糖、1%石膏粉、1%石灰粉、0.2%阿魏根粉、0.01%磷酸二氢钾。

稳渗剂：CPW+9%甘露醇。

离析酶5%，纤维素酶10%，蜗牛酶10%均购自上海生工。

1.3 菌丝培养

阿魏侧耳、糙皮侧耳接种到PDA 平板中[8]，在20 ℃静置培养5d，收集菌体0.1 g备用。

1.4 原生质体制备及纯化

阿魏侧耳1 块菌种块（直径0.5 cm）接种于装有50 mL 液体培养基的250 mL 三角瓶中，20 ℃静置培养5 d。菌丝用四层纱布过滤并用大量无菌水冲洗。取100 mg 置于灭菌的1.5 mL 离心管中，加入1 mL 酶解液（1%纤维素酶和0.5%蜗牛酶），用灭菌的竹签将菌丝稍稍剥离分开，使其与酶解液充分混匀，置于30 ℃水浴中2.5～3 h，涂片镜检，待原生质数量达到105～106个时即成为实验用原生质体。用装有无菌纱布的注射器过滤原生质体液，去除残留菌丝和杂质后，5 000 r/min 离心10 min 以去除酶解液，将原生质体用渗透压稳定剂（0.6 mol/mL 的蔗糖）洗涤2 次后，悬浮，即得到纯化的原生质体[9]。

1.5 糙皮侧耳伏夏200总DNA提取

称取糙皮侧耳子实体放入已冷冻的研钵中，加入2%的PVP，倒入一些液氮，研磨材料，然后加入1mL CTAB[含50 μL DTT（1 Mol/L）]混合，再倒入已加入100 μL 氯仿/辛醇的EP 管中，65 ℃水浴30 min，室温放置15 min 后，再加氯仿/辛醇到1.5 mL，轻轻混匀，13000 rpm离心7 min。取上清液放入干净EP 管中，加入冰的无水乙醇0.5 mL,-20 ℃静置，待出现絮状沉淀时，13 000 rpm 离心7 min，弃上清液。75%酒精/ 0.2 M NaAc 1mL洗涤沉淀2 次，醇挥发后加入无菌水和RNA 酶，溶解，-20 ℃保存。用0.8%琼脂糖电泳检测DNA 的纯度。用分光光度计对DNA 进行紫外扫描，测260 nm、280 nm的吸收值，计算出DNA的浓度，最后用无菌水将DNA浓度稀释到1 μg/μL备用[10]。

1.6 电击转化

采用ECM 630 电激系统，预置电压，电激缓冲液为1 mol/L 的山梨醇。电激前将纯化的原生质体42 ℃浮浴5 min，再向低温处理过的2 mL电激杯加入360 μL 的样品和24 μL 糙皮侧耳DNA 进行电激，冰浴静置 10～15 min 后，，接种在装有3 mL 复苏液体培养基的三角瓶中，80 r/min震荡培养3 d。取600 μL 接种于PDA 平板上，涂布均匀，32 ℃（受体出发菌株菌丝停止生长甚至死亡）下静置培养，随时观察并挑取单菌落。

1.7 再生菌株筛选

将1.6挑取得单菌落和1.4制备的原生质体接种在PDA 平板上，32 ℃下静置培养5 d。测定生长速度，选择生长速度明显高于出发菌株者的再进行出菇复筛。以出发菌株K8 和伏夏200 为对照。培养6～7 d，分别对单菌落进行镜检。

1.8 转化子的验证

分别选取10个纯合耐高温和10个纯合低温型的菌种DNA，分别等量混合构建耐高温池和低温池，用于筛选与耐高温基因紧密连锁的分子标记。利用P.ostreatus基因组序列设计一对有多态的STS标记STS-GX1(F:5′-CTCGACCAAAGATTCGCTGG-3′,R: 5′-TGGTGCCATATCAACTGGGT-3′)，STS 标记对1.7筛选出的再生菌株进行验证。用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，来验证耐高温的转化子。

1.9 转化菌株出菇试验

以生物转化率、子实体的商品性状（色、菇形、菇质）与出发菌株对比，筛选出生物转化率明显提高，并且商品性能同于或优于出发菌株者确定为优良菌株。栽培条件：

1.9.1 温度

菌丝在5～32 在均可生长，以24～26 生为最佳。子实体生长温度14～26 佳，最适温度为16～24适。

1.9.2 湿度和水分

菌丝体和子实体的正常生长发育需要大量水分。菌丝生长期培养基质含水量60%～65%，以62.5%为最佳，料水比为1：1.3～1.5，子实体在空气相对湿度85%～95%时，能够正常发育生长。

1.9.3 空气

阿魏侧耳菌丝对二氧化碳有较高的耐受性，种植耐高温型阿魏菇新品种（＜＜农作物品种登记合格证＞＞新农登字［2015］第58 号，品种名称：高鑫1828），通气量要大于常规阿魏菇一倍以上，子实体才能正常分化、生长出优质菇。

1.9.4 光照

菌丝体生长无需光线，但原基的分化和子实体的正常生长发育需要一定的散射光刺激。耐高温型阿魏侧耳新品种（高鑫1828）散射光照强度在600～1 200lux子实体才能正常生长发育。

1.9.5 酸碱度

阿魏菇菌丝在酸性过强（pH4 以下）的培养基上生长受到抑制。。在pH 值5～11 范围内，阿魏菇菌丝均能生长。但最适pH值为6.5～7.5。

2 结果与分析

2.1 转化效率和验证

通过大量的电激转化试验，规模为1 过大量9～1过大量10个/mL.在32 ℃时，阿魏侧耳K8及其原生质体菌丝均不生长甚至死亡，而供体伏夏200 能正常生长，2 株再生菌株能够生长，电激转化率为10%。得到生长速度高于出发菌株的再生菌株K2株。

图1 筛选出的转化菌株

图2 未转化菌株（对照）

为了进一步验证和确定转化子与出发菌株在遗传上的区别，研究利用分子生物学最新技术，分别设计了15对随机引物，利用RAPD技术，对转化子进行了随机引物PCR 扩增，并对其扩增产物进行了电泳分析。结果表明，绝大多数存在营养不亲合菌株，其随机引物PCR 扩增产物存在不同程度的差别。图3为转化菌株600-5与出发菌NB的RAPD 电泳图，由图可以看出其与出发菌存在多处不同。

图3 出发菌株NB与转化菌株RAPD电泳图

图4 转化子菌株生长速度柱状图

2.3 转化子的鉴定

STS 标记产物大小为231 bp，可用于检测耐高温的阿魏菇转化子。研究结果表明3 为假阳性，4～7为转化子。

图5 STS-GX1标记对耐高温转化子的鉴定

2.4 复筛及转化子的出菇试验：

表1 出菇试验对比

筛选的转化菌株命名为阿魏菇（高鑫1828）。出菇试验结果表明：阿魏菇新种质(高鑫1828)在常温下（大棚室内温度白天25℃左右，夜间17℃左右）能正常出菇（见图6）。农艺性状：子实体单生，白色，马蹄形，直径 10～15 cm，菌肉白色，厚 0.3～6 cm，出菇率100%，生物转化率45%，高产，每个出菇袋两头各出1朵子实体，单朵重175～297 g，生长周期短，出菇时间提前30 d，由120 d提前到90 d。

3 结论

原生质体的制备是应用原生质体技术育种的前提。不同种类的食用菌其原生质体制备的最佳条件不尽相同。制备细胞原生质体时，必须有效地除去细胞壁，而影响原生质体制备的因素很多，其中酶种类和浓度、酶解时间、酶解温度、轻微振荡等都是影响原生质体释放的因素，其中酶解液的往往被认为最重要的因素。因此，本研究按照不同比例将几种酶混合起来，以此来克服单一酶的缺陷性。

食用菌原生质体的获得，因其几乎都是单细胞，而被广泛用于细胞融合、突变、细胞筛选等育种工作。另外，原生质体也是遗传转化的广泛受体之一，在多种植物的基因改造中都被作为接受外源基因的良好受体，进而从原生质体着手进行基因修饰已经成为食用菌育种的有效途径之一[11]。

电激转化技术被证明是一种行之有效的食用菌育种新方法。电转化技术对改良食用真菌的性状和创造新的高产优质菌株具有明显的优势。该方法突出优点是转化效率高且操作简便快速，人为去除细胞壁，解除了菌株间物理上、生理上的主要屏障，因而使食用菌远缘杂交、相同交配型的杂交、及共生菌根菌的驯化栽培成为了可能。

本研究中选用四种稳定渗透液配制酶解液：0.6 M 蔗糖，1 M 山梨醇，0.6 M 甘露醇，CPW+9%甘露醇，再生原生质体分别涂布在再生培养基和PDA培养基上，PDA培养基作为对照，正常情况下，原生质体不能在其上生长。结果显示，用CPW+9%甘露醇作为稳渗剂制备酶解液，产生的原生质体效果最佳，再生效率最高。电激转化电压设400 V，600 V，800 V，1000 V，1200 V，分别进行电激实验，结果发现在电压600 V 下，电击25 μF，在含0.8 mol/L蔗糖的再生培养基上，原生质体再生时间16 d时，再生率可达0.6%。而电压过低时，基因导入率太低；电压过高时，又会使原生质体死亡率过高。参考国内外文献及实验结果，选择再生率为0.6%的电压600 V，电击25 μF作为电击的最佳条件。

食用菌遗传转化技术既有综合不同食用菌遗传信息的重组作用又有剖析基因组基因，转移外源基因的分析作用，对生产实践中创造的食用菌新品种和对食用菌遗传学的基础研究都有十分重要的意义。

本研究获得专利证书（专利名称：电激转化法选育高温型阿魏菇的方法，专利号：ZL 2011 1 0398232.3），并且培育出的阿魏菇新种质（高鑫1828）已通过新疆维吾尔自治区非主要农作物品种登记审定，获得农作物品种登记证书。