miRNA表达谱在肾纤维化中的差异表达及抗纤灵的干预研究

蒋宇峰，朱尧焓，陈 刚，何立群*

（1.上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021；2.上海市中医临床重点实验室，上海 201203）

慢性肾脏病（Chronic kidney disease，CKD）是目前临床上常见疾患，据文献报道[1]，全球成人慢性肾脏病的男女发病率分别高达10.4%和11.8%，可见积极防治CKD有重要现实意义。慢性肾脏病到终末期肾衰主要病理基础就是肾纤维化，其确切的发病机制目前仍不十分明确。MicroRNA（miRNA）是内源性非编码短RNA，它通过在转录之前抑制靶mRNA 达到抑制基因表达的能力。在肾脏疾患中miRNA 与肾脏病变、稳态及生理功能等紧密相连[2]。在肾纤维化研究中TGF-β/Smad 信号通路是最经典主要的通路，据文献研究[3]提示 miRNA 在 TGF-β介导的纤维化中起重要作用。本研究试通过阿霉素肾病大鼠这个平台，来探讨miRNA在抗肾纤维化中的作用，提供中药复方抗纤灵的治疗靶点和机制。

1 材料

1.1 实验动物 SD雄性大鼠48只，体质量（200±20）g，清洁级，上海中医药大学动物房提供，实验大鼠自由饮水进食。

1.2 实验药物 抗纤灵方组成：丹参15 g，制大黄15 g，黄芪15 g，牛膝15 g，桃仁15 g，淫羊藿15 g组成。药物购自上海中医药大学附属曙光医院中药房，按比例称取，水煎浓缩，冰箱保存。科素亚：0.1 g/片，默沙东公司提供，灌胃前用蒸馏水配制成混悬液。

2 方法

2.1 动物造模及分组方法 48只大鼠适应性喂养1周后，其中8只为假手术对照组，仅以打开腹腔，切除右肾，注射同等量生理盐水对照为主。余下采用右肾摘除加重复注射阿霉素的肾衰竭肾纤维化动物模型。常规手术右肾摘除术后一周，予阿霉素5 mg/kg尾静脉注射，术后4周重复注射阿霉素3 mg/kg。术后6周内采血，然后根据肌酐水平随机分成5组：模型组，科素亚组，抗纤灵组低剂量组，中剂量组，高剂量组，每组各8只大鼠。

2.2 给药方法 假手术对照组，模型组给予2 mL生理盐水灌胃，抗纤灵组低，中，高剂量组分别灌服抗纤灵药液2 mL，低，中，高剂量大鼠分别分别以60 kg体质量成人单位剂量的10倍，20倍，30倍，给药剂量相当于 15 g/（kg·d）、30 g/（kg·d）、45 g/（kg·d），对照组科素亚2 mL，剂量33.3 mg/（kg·d），灌胃1次/d，共56 d。

2.3 收集肾组织标本和血、尿标本 6组大鼠连续给药56 d后，在处死前1 d收集24 h尿量，统计尿蛋白定量。处死大鼠时，通过采血腹主动脉3～5 mL后，摘除左肾，清洗后，放入液氮保存，便于后序相关指标检测。

2.4 检测指标 大鼠肾组织TGF-β，Smad3的表达水平采用荧光定量PCR法。取大鼠肾脏组织，以Trizol法抽提RNA。逆转录操作生成cDNA，进行荧光定量操作，循环参数如下：95℃，5 min预变性；95℃，5 s变性，60℃退火30 s，40次循环。所得CT值以2-△△Ct计算mRNA的相对表达量。

Trizol试剂盒提取大鼠肾脏RNA，根据SMARTer smRNA-Seq Kit for Illumina说明书进行文库制备，将样品送至苏州金唯志生物科技有限公司进行高通量测序。

2.5 统计学方法 统计学分析采用SPSS 18.0软件进行，计量资料数据用均数±标准差（±s ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为有统计学意义。利用FastQC来对测序数据质量进行评估，比对大鼠miRNA数据库（Rnor_mir/rno.gff3），对miRNA进行表达定量。对差异表达的基因（DEGs）数据进行聚类分析，生成主成分分析图（PCA）和热图（HCA）。

Keywords:Kangxianling Decoction；renalfibrosis；adriamycin nephropathy；profiles of miRNA expression

3 结果

3.1 荧光定量PCR检测结果 见图1。

图1 Smad3和TGF-β1结果比较

由图1可见，与假手术组相比，模型组及治疗组肾脏组织中TGF-β1、Smad3基因表达均有明显升高，差异具有显著意义（P＜0.05）。与模型组相比，科素亚治疗组和抗纤灵治疗组肾脏中TGF-β1、Smad3表达量降低，其中科素亚治疗组具有明显统计学差异（P＜0.05），抗纤灵随着用药剂量的增加，差异开始显现（P＞0.05，P＜0.05，P＜0.001）。

3.2 主成分分析/聚类分析 见图2。

图2 主成分分析

在PC1层面，假手术组（NC）和模型组（OC）相距最远，表示NC组和OC组样本的生物学差异较大，其他组（治疗组）则介于NC和OC的中间位置，高抗纤灵组（HK）与假手术组（NC）最接近。

3.3 HCA聚类匹配 见图3。

图3 HCA聚类分析

HCA聚类分析如图3所示，从聚类关系上，OC组独立于其他分组聚到一起，说明肾纤维化的建模取得了成功，其他治疗组在一定程度上都起到了肾脏的修复的作用；其中HK组整体上与NC组跟接近，KS组次之，MK和LK的聚类更远。

3.4 miRNA差异表达分析 见图4。

图4 与模型组差异表达的miRNA数目比较

我们将假手术组（NC）和药物处理组（HK，MK，LK，KS）的miRNA表达谱分别与模型组（OC）进行了比较。采用基因表达倍数变化大于1.5和t检验，P＜0.05为标准进行差异表达基因的筛选。并对差异表达基因的数量进行了统计。纵坐标表示差异表达基因数量，数量越多，差异越大。从图4中可以看出，NC组与OC组的差异最大，其次是高剂量治疗组（HK），再次是KS组和MK，LK组与OC组的差异较小。

4 讨论

肾纤维化是各种原因引起终末期肾病（ESRD）的的共同病理基础，早期延缓，具有非常重要的现实意义。目前，尚缺乏有效生物诊断早期标志物和治疗手段，TGF-β/Smads是公认促肾纤维化最主要的信号通路[4]，miRNAs 的发现为评估及治疗为肾纤维化提供了全新的视角和方向。miRNAs 是一类长度约22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，在生长发育、细胞分化、增殖、凋亡、肿瘤发生等过程中发挥重要作用。miRNAs在肾脏纤维化发展过程中存在异常表达，提示它可能参与肾脏纤维化的过程并起到重要作用[5]。

肾纤维化中TGF-β1是最重要的促纤维细胞因子[6]，其受体效应蛋白Smad在肾纤维化中也起到重要作用，Smad3 作为通路限制性分子之一，被TGF-β1激活，调节靶蛋白的表达[7]。通过本实验发现模型组TGF-β1、Smad3基因表达均有升高，经治疗后比较，TGF-β1、Smad3表达量降低，有明显统计学差异，其中抗纤灵随着用药剂量的增加，差异开始显现显著，提示治疗效果的不断好转，推测通过抑制TGF-β1表达，下调Smad3，从而调节靶蛋白（如ECM）的表达，达到减轻 ECM 聚积，延缓肾硬化的的发生。

本研究通过miRNA表达谱主成分分析发现，表达谱相似的样本会被聚集在一起。NC组（空白）和OC组（模型组）相距最远，两者的生物学差异较大，其中高纤灵组其表达谱位置较中纤灵组，科素压组位置与空白组相距位置更为接近，从而提示高纤灵组具有更好的疗效。同样通过HCA聚类匹配分析发现，NC组的聚类与HK（高剂量）组最为接近，说明高剂量的抗纤灵治疗更接近空白对照，其对肾脏的修复程度最好，而KS（科素亚组），MK（中剂量组）则效果次之。通过miRNA表达谱差异表达分析， NC组与OC组的差异最大，其次是高剂量治疗组（HK），再次是KS组，最后是MK组；MK组与OC组的差异较小，说明高剂量治疗组的基因表达谱变化最接近空白对照组变化，提示药物处理剂量越大，样本的表达谱越与对照NC组相近，表明随着剂量增大抗纤维化的效果越好。

抗纤灵方为上海中医药大学附属曙光医院何立群教授的经验方，该方以活血化瘀，补肾益气为治则，与慢性肾衰的中医病机，正气亏虚，气虚血滞，络脉瘀阻的不谋而合。方中黄芪补气升阳，仙灵脾温阳补肾，两者为君药；丹参益气活血，桃仁祛瘀活血，牛膝补肾活血，此三药为臣；制大黄清热泄浊活血，为本方佐药。抗纤灵方以活血为主，兼以扶正泄浊，攻补兼施，使泻而不伤正，补而不滞邪。该方在临床和动物实验研究抗肾纤维化取得较好疗效[8-9]。本实验证实抗纤灵方治疗后，无论是在TGF-β1/Smad3 mRNA的表达，还是miRNA表达谱的差异改变，抗纤灵都呈现剂量效应，表明肾脏的纤维化程度改善跟抗纤灵剂量大小有关，同时其中显现的差异基因有待进一步通过后续试验筛选和验证。

综上所述，抗纤灵方通过益气活血补肾作用，减少TGF-β1、Smad3基因表达，而起到抗肾纤维化作用，保护肾脏。推测其机理可能通过调节miRNA谱改变，来发挥作用，并且抗纤维化作用与剂量呈依赖关系。