风味蛋白酶对贵州腊肉蛋白质水解度、 抗氧化能力和感官品质的影响

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(1.南京师范大学金陵女子学院,江苏南京 210097; 2.南京农业大学肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心,江苏南京 210095; 3.江苏省生产力促进中心,江苏南京 210042)

贵州腊肉是一种以鲜(冻)猪肉为原料,配以各种调味料,经腌制、脱水(晾晒或风干)、烟熏(或不烟熏)等工艺加工而成的生肉制品[1]。一般产品表面色泽金黄,肉身干燥,肥膘透明,能较长时间保存且不易腐败,其独特的腌腊风味深受消费者喜爱。作为一种极具地方特色的传统美食长期流行于我国贵州省等西南地区。

腊肉的成熟主要是在内源酶系的作用下使蛋白质和脂肪等大分子营养物质充分水解,其中水解产物小肽、游离氨基酸和游离脂肪酸是重要的风味前体物质[2-3]。传统的腊肉加工经腌制后在自然条件下使腊肉缓慢风干成熟,生产周期较长。为缩短生产周期,现代工厂一般采用高温(60 ℃)烘干替代自然风干,生产周期控制在2～3 d[4-5]。但猪肉中内源酶系的活性在高温下容易受到抑制,使腊肉中蛋白质水解度下降,风味和滋味物质含量显著降低[6-7],此外干腌肉制品中的脂肪和蛋白质在高温下容易加速氧化使产品风味劣变[8]。因此,在腊肉中添加外源酶以替代内源酶促进蛋白质水解形成风味前体物质,同时提高产品的抗氧化稳定性,在腊肉的现代化工艺改造过程中显得尤为重要。朱建军等[9]将木瓜蛋白酶和中性蛋白酶应用于腊肉中,发现外源酶有效提高了蛋白质的分解速度,提高风味物质的含量;Fernandez等[10]将胰脂酶添加到发酵香肠中,可以短时间内提升产品风味。穆建稳等[11]在腊牛肉腌制中将中性蛋白酶掺入腌制剂中腌制7 d,发现肌肉蛋白质在酶的作用下发生了强烈降解。在一定的添加范围内,降解程度随着酶添加量增大而提高。

风味蛋白酶由米曲霉发酵产生,同时具备内切酶和外切酶活性,是一种广泛运用的商业酶[12-13]。用风味蛋白酶水解花生蛋白[14]、鲤鱼蛋白[15]、油菜籽蛋白[16]等,水解产物具有很强的抗氧化活性,该酶被广泛用于干腌发酵香肠[17]、腌腊鸡腿肉[18]等的风味改良,且对加速奶酪[19]的成熟效果显著。目前尚未发现风味蛋白酶在贵州腊肉成熟过程中应用的相关报道,风味蛋白酶促进腊肉蛋白质水解,影响腊肉抗氧化稳定性的研究也不多见,本研究旨在通过在贵州腊肉腌制过程中添加不同剂量的风味蛋白酶,以期增加腊肉中蛋白质水解度、游离氨基酸含量等,增强产品抗氧化稳定性和提升感官品质,以弥补高温工艺对腊肉品质的损害,使经高温快速成熟工艺制作的腊肉在最大程度上保留传统贵州腊肉的感官品质,为贵州腊肉产品企业标准化和规范化生产提供参考借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜五花肉(黑猪,取自同一头猪胴体) 南京雨润食品有限公司;风味蛋白酶(1.5×104U/g) 南宁庞博生物工程有限公司;三氯乙酸 上海凌峰化学试剂有限公司;硫代巴比妥酸(TBA) 国药集团化学试剂有限公司;其他试剂 均为分析纯。

ESK125型真空滚揉机 德国VAKONA CmbH公司;DC800-FB-E型真空包装机 希悦尔(中国)有限公司;V-5000可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;L8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司;JA2103N型精密天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;电热烤箱 德国CONVOTHERM公司;CR-410型色差仪 柯尼卡美能达(中国)投资有限公司;L-3000型全自动氨基酸分析仪 苏州华美辰公司。

1.2 实验方法

1.2.1 腊肉的加工工艺 猪五花肉除去筋膜,修整成规则的长条形,长15～20 cm,宽5～7 cm,厚3～4 cm。辅料(质量分数):白砂糖1%,葡萄糖0.5%,食盐2%,曲酒0.6%,味精0.1%,亚硝酸钠0.001%,水5%,配制成腌制液。实验组F2、F4、F6分别在腌制液中加入2.0×105、4.0×105、6.0×105U/kg的风味蛋白酶[3,12]。对照组(CT)为传统工艺自然风干至水分含量≤25%的贵州腊肉(春秋季一般为25～30 d)。空白组(NT)不添加风味蛋白酶经60 ℃烘干至水分含量≤25%的贵州腊肉(一般为24～28 h)。

加工工艺流程:

1.2.2 取样 腊肉成品真空包装后4 ℃冰箱冷藏24 h,每组随机取5块腊肉进行检测,其中脂肪氧化指标(酸价、过氧化值和丙二醛含量)测定选取腊肉中肥肉部位进行测定,其它指标均选取腊肉中瘦肉部位进行测定,腊肉取样部位尽可能保持一致,以减少取样环节对实验结果造成的影响。

1.2.3 腊肉水分含量、水分活度及pH测定 腊肉中水分含量测定按照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准:食品中水分的测定》[20]直接干燥法进行;腊肉水分活度测定采用水分活度测定仪在25 ℃下进行。pH值测定按照GB 5009.237-2016《食品安全国家标准:食品pH的测定》[21]。每个样品设三个平行,结果以平均值±标准差表示。

1.2.4 腊肉蛋白质水解度的测定 蛋白质水解度以腊肉中氨基酸态氮和总氮的比值表示,氨基酸态氮的测定按照GB 5009.235-2016《食品安全国家标准:食品中氨基酸态氮的测定》[22]中的酸度计法进行;总氮测定(total nitrogen,TN)按照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准:食品中蛋白质的测定》[23]中的凯氏定氮法进行。

1.2.5 游离氨基酸的测定 按照GB5009.124-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸含量的测定》[24]利用氨基酸分析仪进行测定,略有修改。具体操作简述如下:称取腊肉样品1.00 g于水解管中,加入10 mL 6 mol/L的盐酸,4滴苯酚,放入冷冻剂中冷冻5 min,抽真空后充入氮气重复三次,在第三次充氮气时封口,封口后的水解管置于110 ℃鼓风干燥箱内恒温水解22 h,取出冷却至室温。水解液经中速定性滤纸过滤,滤液用50 mL容量瓶定容,取1 mL滤液于试管中,在离心浓缩仪上蒸干,加入1 mL pH2.2柠檬酸钠缓冲液,振荡溶解均匀,通过0.22 μm滤膜,滤液为待测液。色谱柱为磺酸型阳离子树脂,2.6×150 mm;可见光检测器,波长570、440 nm;流动相为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲液;流速225 μL/min;进样量50 μL。

1.2.6 腊肉中多肽提取与抗氧化活性的测定 腊肉中多肽的提取参照王雪芹的试验方法[25]并略作修改,具体如下:取各组腊肉样品10.00 g,加入35 mL pH7.2的磷酸缓冲液,冰浴下高速均质2 min,经高速冷冻离心机离心20 min(4 ℃,30000 r/min),取上清液,上清液通过5000 Da超滤膜,滤出液为多肽提取液,用1 mol/L NaOH调至pH7.2,冻干保存,使用时用去离子水配制成浓度为1 mg/mL多肽液。

多肽提取液OH·自由基清除力测定结合Yildirim等[26]和You等[27]的方法并作适当修改。取各实验组多肽提取液各1 mL,加入0.5 mL 2 mmol/L EDTA-Fe溶液,1 mL磷酸盐缓冲液(150 mmol/L,pH7.4),1 mL番花红(360 μg/mL),1 mL 3% H2O2,在涡旋混合器上混合均匀,37 ℃水浴30 min,520 nm比色,测定吸光值。空白组用缓冲液替代多肽液,对照用缓冲液替代多肽液和过氧化氢,每个浓度做3个平行,结果用清除率(E)表示。

1.2.7 蛋白羰基含量的测定 腊肉中蛋白提取参考曹云刚[28]的试验方法并略作修改:称取3.00 g腊肉,加入30 mL 0.15 mol/L的KCl溶液,均质1 min,取200 μL均质液于1 mL棕色离心管中,加入0.5 mL 20%(w/v)三氯乙酸,旋涡混合均匀,30000 r/min离心10 min,弃上清,沉淀为蛋白提取物,加入适量KCl溶液溶解蛋白,调整蛋白浓度为20 mg/mL。

腊肉中蛋白羰基含量测定参考Li等[29]方法并略作修改:准确吸取200 μL蛋白提取液于2 mL棕色塑料离心管中,加入0.5 mL 10 mmol/L DNPH,室温下避光反应1 h,加入0.5 mL 20%三氯乙酸涡旋混匀,终止反应,30000 r/min离心5 min,沉淀经1 mL洗液(乙醇/乙酸乙酯等体积混合)充分洗涤后,同样条件下离心,重复三次。沉淀洗涤后晾干,加入1.5 mL 6 mol/L 盐酸胍溶液,50 ℃ 水浴30 min,30000 r/min离心10 min。上清液于370 nm比色测定羰基含量,280 nm比色测定蛋白含量(以 BSA 为标准蛋白)。羰基含量采用摩尔消光系数进行计算。同时做样品空白。计算公式如下:

A=εbc

其中:ε为摩尔消光系数22000,b为光程长度1 cm,c为溶液浓度(mol/L)

1.2.8 脂肪氧化指标的测定 腊肉酸价测定按照GB5009.229-2016 食品中酸价的测定[30]冷溶剂滴定法进行。过氧化值测定按照国标GB5009.227-2016 食品中过氧化值的测定[31]滴定法进行。丙二醛含量测定,按照国标GB5009.181-2016 食品中丙二醛的测定[32]分光光度法进行。

1.2.9 腊肉硬度测定 各组腊肉样品放置到室温后切割成8 cm×8 cm×5 mm的腊肉片,分别装入聚乙烯包装袋中,用真空包装机抽真空并封口,在水浴锅中72 ℃水浴20 min[13],取出,用质构仪测定硬度。测试方法选择“压缩试验”,选用2 mm柱状不锈钢探头,触发值5 g,测试速度30 mm/min,返回速度为最大速度,目标值“形变量60%”,每组样品测5组数据[33]。

1.2.10 感官评定 感官评定参照GB/T 22210-2008 肉与肉制品感官评定规范[34]进行,由实验室10位接受过专业训练的实验员组成感官评定小组,采用9分嗜好法[35]进行评价。评价标准如表1所示。

表1 感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standard

1.3 统计分析

数据统计采用SAS 8.12进行ANOVA单因素方差分析及Ducan’s多重检验(p<0.05),数据以平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 腊肉水分含量、水分活度及pH分析

各组腊肉水分含量、水分活度和pH测定结果如表2所示,5组腊肉分别经风干或高温烘干脱水后水分含量都控制在24%～25%之间,水分活度在0.65左右,各组间没有显著差异(p>0.05)。NT组与CT组相比pH显著下降(p<0.05),这主要是由于脂肪在烘烤或高温处理下会加速氧化使产品pH下降[10,36],脂肪酸价测定实验结果也验证了这一点。实验组中加入风味蛋白酶后pH与CT组相比也显著下降(p<0.05)。这主要是由于风味蛋白酶在促进腊肉蛋白质水解过程中释放出H+导致的[37]。

表2 风味蛋白酶添加量对贵州腊肉 水分含量、水分活度、pH的影响Table 2 Effect of flavourzyme levels on moisture content, water activity(Aw)and pH values of Guizhou bacon

2.2 风味蛋白酶对腊肉蛋白质的水解作用

2.2.1 风味蛋白酶对腊肉蛋白质水解度的影响 各组腊肉蛋白质水解度测定结果如表3,总氮含量在各组间没有显著差异(p>0.05),NT组非蛋白氮含量和水解度显著低于CT组(p<0.05),表明高温快速成熟工艺使腊肉蛋白质水解度显著下降。在加入风味蛋白酶后腊肉中非蛋白氮含量与蛋白质水解度显著上升(p<0.05),当风味蛋白酶添加量分别为2×105、4×105、6×105U/kg时,腊肉非蛋白氮依次达到5.25、6.35、7.18 g/100 g,水解度依次为16.76%、20.72%和23.70%,且添加风味蛋白酶的3组腊肉非蛋白氮与蛋白质水解度均显著高于CT组,在实验范围内腊肉中非蛋白氮含量的增加与风味蛋白酶添加量呈正相关,相关系数R2=0.9524。结果表明在高温快速成熟工艺中使用风味蛋白酶能有效促进腊肉蛋白质水解,添加量为2×105U/kg时,蛋白质水解度已显著高于CT组(p<0.05)。

表3 风味蛋白酶添加量对腊肉蛋白质水解度的影响Table 3 Effects of flavourzyme levels on degree of hydrolysis

2.2.2 风味蛋白酶对腊肉中游离氨基酸含量的影响 腊肉中游离氨基酸测定结果如表4,NT组16种游离氨基酸含量显著低于CT组,说明高温快速成熟工艺使贵州腊肉中游离氨基酸含量降低,这可能与内源蛋白酶活性受到抑制导致腊肉中蛋白质水解度下降有关[6-7]。在腊肉中加入风味蛋白酶后游离氨基酸含量显著提高,且随风味蛋白酶添加量的增加,16种游离氨基酸含量也显著增加。当风味蛋白酶添加量达到2×105U/kg时,腊肉中16种游离氨基酸含量显著(p<0.05)高于CT组。

表4 风味蛋白酶添加量对腊肉中游离氨基酸含量的影响Table 4 Effects of flavourzyme levels on free amino acid(FAA)

风味蛋白酶运用在花生蛋白[14]、鲤鱼蛋白[15]水解中也能显著提高水解液游离氨基酸的含量。游离氨基酸是重要的滋味物质也是形成挥发性风味物质的重要前体,它们容易与糖类发生美拉德反应产生风味化合物[38],对腊肉的感官品质有重要作用。

2.3 风味蛋白酶对腊肉氧化稳定性的影响

实验结果如表5所示,加入风味蛋白酶后,腊肉多肽提取液清除羟自由基的能力增强,且风味蛋白酶添加量越高,羟自由基清除力越强。腊肉经风味蛋白酶水解后表现出更强的抗氧化活性主要是由于水解过程中产生的芳香族氨基酸可以提供H+,使自由基链式反应减慢或终止[40]。也有研究认为富含疏水性氨基酸或含硫氨基酸的多肽具有较强的抗氧化活性,如鲐鱼蛋白、豌豆蛋白经风味蛋白酶水解后多肽提取液抗氧化活性提高,能有效清除·OH、DPPH·、ABTS+·等自由基[25,39]。NT组蛋白羰基含量和脂肪酸价、过氧化值、硫代巴比妥酸值都显著高于CT组(p<0.05),表明高温快速成熟工艺使腊肉中蛋白质和脂肪氧化加剧[41],加入风味蛋白酶后蛋白羰基含量和脂肪酸价、过氧化值、硫代巴比妥酸值显著下降(p<0.05),表明风味蛋白酶可以提高腊肉生产过程中蛋白质和脂肪的氧化稳定性。这一方面是由于风味蛋白酶使腊肉中产生更多具有抗氧化活性的小肽,另一方面也有可能是由于水解腊肉蛋白产生的小肽能在脂质体表面形成物理壁垒,阻碍氧化剂的渗入和扩散[39],从而增强了腊肉中蛋白质和脂肪的氧化稳定性。

表5 风味蛋白酶添加量对腊肉抗氧化活性以及蛋白质和脂肪氧化程度的影响Table 5 Effect of flavourzyme levels on the antioxidant activity of peptide extraction and protein and lipid oxidation in Guizhou bacon

2.4 风味蛋白酶对腊肉硬度及感官品质的影响

各组腊肉硬度测定结果如表6所示,NT组硬度显著高于CT组(p<0.05),这可能与NT组蛋白水解度过低有关[13]。加入风味蛋白酶后硬度显著降低,且不同剂量组间有显著差异,其变化趋势与蛋白质水解度相同。这与Benito等[42]和张思宇等[13]研究结果相似。风味蛋白酶对腊肉硬度的影响主要是由蛋白酶对肌原纤维的水解作用以及对蛋白持水性的影响造成的[42]。但是过度的蛋白水解(6×105U/kg)使腊肉硬度过低,反而使贵州腊肉的食用品质下降。

表6 风味蛋白酶添加量对腊肉硬度与感官品质的影响Table 6 Effect of flavourzyme levels on hardness and sensory quality of Guizhou bacon

感官评分包括色泽、口感、气味、滋味和总体可接受度,对五组贵州腊肉评分结果(表6)表明风味蛋白酶添加量为2×105U/kg(F2组)时腊肉感官品质最好,与CT组相比没有显著差异,有明显的贵州腊肉特征风味。NT组和风味蛋白酶添加量为4×105U/kg(F4)组与CT组腊肉相比,在气味上有显著差异(p<0.05),但总体可接受度尚可。风味蛋白酶添加量为6×105U/kg(F6)组与传统贵州腊肉(CT组)在口感、气味、滋味上均有显著差异(p<0.05),尤其是在口感上与传统腊肉软硬适中的口感相比过于柔软,硬度只有CT组的59.4%,咀嚼性较差,腊肉食用品质较低,总体可接受度较差。

3 结论

风味蛋白酶可以有效促进贵州腊肉蛋白质的水解,提高腊肉中游离氨基酸含量。风味蛋白酶水解腊肉蛋白有较强的抗氧化活性,能有效清除腊肉中的·OH,能显著提高腊肉在高温快速成熟工艺中的氧化稳定性,使蛋白羰基含量、脂肪酸价和过氧化值显著降低。当风味蛋白酶添加量为2×105U/kg时,腊肉的风味和滋味特征与传统贵州腊肉没有显著差异(p<0.05),当风味蛋白酶添加量为4×105U/kg时,腊肉的风味和滋味特征与传统贵州腊肉有显著差异,风味蛋白酶添加量为6×105U/kg时腊肉蛋白因水解过度硬度和咀嚼性过低严重影响食用品质。风味蛋白酶在贵州腊肉高温快速成熟工艺中的适宜用量为2×105U/kg原料,配制在腌制液中添加,腊肉蛋白质水解度、蛋白质和脂肪氧化稳定性均显著高于传统工艺生产的腊肉,感官品质与传统腊肉相比没有显著差异。