大麦蛋白质含量与SSR标记的关联分析

司二静，杨淑莲，孟亚雄，李葆春，马小乐， 汪军成， 任盼荣，姚立蓉，张 宇，王化俊

(1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃兰州 730070； 2.甘肃农业大学农院，甘肃兰州 730070；3.甘肃农业大学档案馆，甘肃兰州 730070； 4.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070；5.甘肃省种子管理局，甘肃兰州 730020)

大麦作为全球第四大禾谷类作物，因其较强的抗旱、耐贫瘠和耐盐性被广范种植，且具有良好的饲用、食用和啤用价值。籽粒蛋白质含量是决定大麦用途的重要性状之一，饲用、食用和啤用大麦对籽粒蛋白质含量要求不尽相同，如啤用大麦蛋白质含量一般要求在9.0%～12.0%之间，而饲用和食用大麦则蛋白质含量越高越好，优质饲用和食用大麦的籽粒蛋白质含量一般要求大于13.0%[1]。大麦籽粒蛋白质含量受环境条件影响，但主要由遗传因素控制[2]，且由主效基因和若干微效基因共同控制[3]。Marquez-Cedillo等[4]利用双单倍体群体对麦芽质量相关性状进行QTL定位，分别在2H、4H和5H上检测到与大麦蛋白质含量相关的QTL，标记区间依次为vrs1-MWG503、INT-C-HVM40和MWG635d-ABC302a。

关联分析通过对关联群体的候选基因检测或者分子标记扫描，得到丰富的基因位点及其等位基因信息，进一步与相关性状关联，分析鉴定出对其目标性状有正向贡献的优异等位基因[5]。在小麦[6-7]、玉米[8-9]、水稻[10-11]和大麦[12-16]等作物中均有关联分析应用的报道，已有对大麦性状的关联分析主要涉及耐胁迫[12-13]、抗病[14-16]、农艺性状[17-20]等，而关于以大麦籽粒蛋白质含量为目标性状进行关联分析的研究还未见报道。

本研究拟运用SSR标记对大麦材料进行群体结构分析，并通过SSR标记与目标性状的关联分析，探讨与大麦蛋白质含量相关联的SSR标记，为大麦的分子辅助选择育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的93份大麦材料由甘肃农业大学甘肃省干旱生境作物学重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室麦类种质创新课题组和甘肃省农业科学院大麦研究所提供，来源及编号见表1。2015年3月将93份大麦材料点播种植于甘肃农业大学黄羊镇实验田。采用常规田间管理，成熟期收获并测定蛋白质含量。

表1 供试材料来源Table 1 Origin of materials used in the study

1.2 籽粒蛋白质含量的测定

用近红外线分析仪(Foss NIR system)测定大麦籽粒蛋白质含量。

1.3 SSR标记分析

在直径9 cm培养皿中进行不同大麦品种萌发，22 ℃黑暗培养2周后采集大麦叶片，在研钵中添加液氮后进行样品研磨，运用CTAB法[21-22]提取基因组DNA，-20 ℃保存备用。参考Grain Genes 2.0网站、Korff等[23]构建的遗传图谱、司二静等[20]研究结果，按遗传距离选取93个均匀分布于大麦1H～7H染色体的SSR标记(表2)对93份大麦材料的DNA进行PCR扩增 。扩增体系为10 μL，包括5 μL 2×MasterMix (BIOTEKE，PR1701)，上下游引物各1 μL(10 μmol)，1 μL模板(60 ng·μL-1)，加ddH2O至10 μL。扩增程序为95 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，64～55 ℃(touch-down PCR)50 s，72 ℃ 50 s，10个循环；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。PCR扩增产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色。

每对SSR引物扩增的每一条带记为1个位点，基因型以大写字母A、B、C等表示。运用Power marker V3.25对93个标记进行多态性统计；以Structure 2.3.1软件进行群体结构分析，估计最佳群体数K，其取值范围为1～10，将参数iterations设为10 000，burn-in period 设为100 000，每个K值重复运行5次，依据似然值最大原则选取合适的K值为群体数目[24]。当K值持续增大时，参照Evanno等[25]方法计算ΔK，选择合适的K值，计算Q参数，将其作为协变量，运用Tassel 2.1软件一般线性模型(general linear model，GLM)，将Q作为协变量进行回归分析，混合线性模型(mixed linear model，MLM)采用Q+K方法，分析方法选择EM，运用蛋白质含量与分子标记数据，并结合群体结构数据进行SSR-蛋白质含量关联分析，确定与蛋白质含量相关联的位点。

2 结果与分析

2.1 供试大麦的蛋白质含量

供试的93份大麦材料中，蛋白质含量变化范围为8.4%～15.8%，西安91-2含量最高(15.8%)，其次为EMPRESS(15.4%)，而法尔非特的蛋白质含量最低(8.4%)；蛋白质含量平均为11.7%，标准差为1.7，变异系数是14.6%。不同来源大麦材料的蛋白质含量差异程度不同，来源于匈牙利的大麦(5)蛋白质含量较高，平均为12.9%；来源于德国(19)、美国(25)、日本(4)、中国(34)的大麦平均蛋白质含量依次为11.5%、11.7%、11.9%和11.9%，而来源于叙利亚(2)的大麦平均蛋白质含量最低，为10.8%。来源于澳大利亚、波兰、丹麦和法国的大麦材料均为一份，蛋白质含量依次为12.2%、10.0%、10.4%和12.8%。国内不同省份大麦材料蛋白质含量差异较大，来源于山东的大麦平均蛋白质含量最高，为12.9%，来源于福建、浙江、甘肃和内蒙古的平均蛋白质含量依次为12.6%、12.3%、11.3%和10.6%，来源于北京、湖北、江苏、山西、陕西和西藏均为1份材料，蛋白质含量依次为13.7%、13.4%、9.0%、11.9%、15.8%和14.3%，来源于国家库的两份永久保存大麦材料平均蛋白质含量为11.2%。

2.2 SSR标记分析

利用93个SSR标记对93份大麦材料进行多态性分析，共检测出等位变异406个，变化范围为2～9，其中，标记Bmac40和Bmag0225的等位变异最多，均为9个，其次是Bmag0872、Bmag603和Bmag0812，均为8个，有8个标记(HVABAIP、HVM54、MGB334、MGB384、Bmac0163、HVM31、GBM1140和GBM1456)的等位变异较少，均为2个。基因多样性变化范围为0.021 3～0.862 0，平均为0.575 6；PIC变化范围为0.021 0～0.648 5，平均为0.521 4，基因多样性和PIC均以标记Bmac40最高，GBM1140最低(表2)。以PIC≥0.5为高多态性位点，0.25

表2 93对SSR多态性统计Table 2 Polymorphic statistics of 93 SSR markers

(续表2 Continued table 2)

(续表2 Continued table 2)

2.3 群体结构分析

运用多态性较好的引物对93份大麦材料进行群体结构分析。由图1A可以看出，随着K值增大，LnP(D)持续增大，无明显拐点，故不能判断亚群数，需要通过ΔK来进一步确定该群体的亚群数[25]。由图1B可以看出，在K=5时出现明显峰值，供试材料被划分为5个亚群，分别包含18、23、15、22和15份材料(图1C)。当某个品种在某亚群中的Q≥0.6时，认为该品种来源较为单一，若小于0.6则认为有混合来源[26]。93材料中，Q<0.6的材料有34份，占总数的36.56%，表明这34份材料来源背景复杂，而Q>0.6的材料有59份，占总数的63.44%，表明这些材料来源较为单一。

A：LnP(D)值随K值变化折线图；B：ΔK 值随K值变化折线图； C：93 份材料分为5个亚群。

2.4 SSR标记与蛋白质含量关联分析

运用不同大麦材料的蛋白质含量与93个SSR标记进行关联分析，GLM模型检测结果显示，所检测的93个SSR标记中，共检测到9个与大麦蛋白质含量显著相关的标记(P<0.05)，对表型变异的解释率在7.49%～14.13%间，分布于染色体3H、4H、5H、6H和7H上，其中，位于染色体5H上的标记GMS061与蛋白质含量极显著相关(P<0.01)，表型变异解释率为13.98%。MLM模型所检测到的SSR标记相关性与GLM结果一致，但MLM中关联标记的变异解释率较GLM低，对表型变异的解释率为7.30%～13.97%，标记GMS061与蛋白质含量的相关也达到极显著水平，对表型变异的解释率为13.84%。

表3 与蛋白质含量相关的标记P值及其对表型变异的解释率Table 3 Significance and explained phenotypic variation of the marker associated with barley protein content

3 讨 论

籽粒蛋白质含量是衡量大麦品质的一个重要指标，如优级啤麦、一级啤麦和二级啤麦对籽粒蛋白质含量的要求分别是≤12.0%、12.0%～12.5%以及12.5%～13.5%[27]。本研究中，蛋白质含量在9.0%～12.0%之间的材料共51份，占总材料的54.8%，而蛋白质含量在12.0%～12.5%和12.5%～13.5%的分别包含7份和15份，分别占总材料的7.5%和16.1%，其蛋白质含量均符合啤用大麦要求；蛋白质含量大于13.5%的材料共17份，占总材料的18.3%，可食用和饲用。供试大麦蛋白质含量为8.4%～15.8%，平均为11.7%，与许如根等[28]和马得泉等[29]研究结果不同，这可能与供试大麦材料来源和数量有关，许如根等[28]仅选用国内7个大麦品种，而本研究大麦材料来源更广泛；马得泉等[29]选用的是西藏野生大麦，而西藏野生大麦蛋白质含量较高[30]。大麦籽粒蛋白质含量不仅受基因型控制，还受其他因素影响，如气象因子、栽培措施和环境条件等[31]，这些因素影响程度的确定还需进行多年多点试验。

因群体结构能增加染色体间的连锁不平衡，致使目的性状与不相关位点表现出关联，即造成了伪关联，因此关联分析前需要进行群体结构分析，进而减少群体结构对关联分析结果的影响，避免人为因素对亚群划分的影响，通过降低伪关联概率提高关联分析结果准确性[32-33]。本研究中，经群体结构分析，供试材料被划分为5个亚群，并将Q值作为协变量纳入计算，在一定程度上降低了亚群混合造成的伪关联概率[34]。蛋白质含量相关QTL报道较少，只在2H、4H和5H上鉴定到，本研究经GLM和MLM模型分析均将9个与蛋白质含量相关的SSR标记定位在3H、4H、5H、6H和7H上，只有标记HVM40与Marquez-Cedillo等[4]结果一致，而其他8个标记与前人研究结果差异较大，需进一步验证标记的可靠性。本研究中，MLM模型检测到的关联标记对表型变异的解释率较GLM中检测到的关联标记对表型变异的解释率低，主要原因可能是MLM模型不仅考虑群体结构Q的影响，还考虑了亲缘关系K对关联分析的影响，结果比较准确可靠。