一种“裸眼”可视化检测溶液的pH值及细胞中铁离子的BODIPY类探针

渠星宇 边永军＊, 白 杨 沈 珍

(1晋中学院化学化工学院，晋中 030619)(2南京大学化学化工学院，配位化学国家重点实验室，南京 210023)

铁是人体血液中交换和输送氧所必需的一种元素，体内大部分铁以离子形式分布在特殊的血细胞中[1]。人体中铁离子含量过多或过少都会带来疾病，甚至死亡。因此，准确及时地检测生物体内铁离子的含量非常有意义[2]。目前检测铁离子的方法有很多，例如：原子吸收、耦合等离子质谱法、电化学法、荧光分析法[3-6]等。荧光分析法作为一种新型发展起来的检测方法，具有操作简单、检测速度快、无破坏性等优点，已经成为一种十分实用的检测方法[7-8]。但荧光分析法中有一个急需解决的问题，即：需合成灵敏度高、选择性好、溶解性好的荧光探针。硼氟二吡咯亚甲基(BODIPY)类荧光染料具有许多优良的光物理性质[9]，例如：摩尔吸光系数高，荧光量子产率高，结构易修饰等，已被广泛地应用到设计合成Fe3+荧光探针。2005年Bricks等[10]首次报道了一种荧光增强型的Fe3+荧光探针，即在BODIPY荧光染料的中位引入大环，发现该大环可以选择性地与 Fe3+配合(配位比为 1∶1)。随后，多种 BODIPY 类探针被合成并被应用到检测细胞中Fe3+的含量，即通过在BODIPY的母核中位引入羟胺基团[11]、N-吡啶基 N-噻吩基胺基[12]、2-喹啉噻吩基团[13-14]，利用光诱导电子转移(PET)机理达到荧光强度改变的目的进而检测细胞中Fe3+的含量。此外，在BODIPY母核的3-，5-位引入对羟基苯乙烯基[15-17]、对磺酸基苯乙烯基[18]、席夫碱类基团[19-21]，通过光诱导分子内电荷转移(ICT)机理引起探针光谱性质的改变，达到检测Fe3+。

测定溶液pH值的变化对于许多领域都有非常重要的意义，这些领域包括化学、生物、工业生产等[22]。对于生物分析方面，设计合成pH探针，用于检测生物细胞的变化、生理反应过程等具有重要的意义[23]。 文献报道，将(N，N-二甲基)胺基团[24-27]或者苯酚基团[28-29]作为pH值的识别基团，引入到BODIPY母核的中位，利用PET原理达到检测溶液及生物细胞中pH值的目的。文献报道把吗啡啉基团[30-31]引入到 BODIPY 母核的 1-，7-或 3-，5-位或者2-，6-位，利用ICT或PET原理可以实现检测溶液的pH值。

本论文选用荧光量子产率接近1的BODIPY化合物1作为荧光基团，选用对羟基苯乙烯基团作为功能基团，合理的将功能基团修饰到BODIIPY母核的3-位，得到探针2。尽管文献曾报道[32]探针2通过化合物1和对羟基苯甲醛反应得到，但是产率较低且没有研究该化合物的光物理性质。本文选用吡啶-2-甲酸(4-甲酰基苯酚)酯代替对羟基苯甲醛，与化合物1反应得到探针2，产率为39%。实验结果表明，探针2基于ICT原理，可以识别弱酸性溶液的pH值，也可以选择性地检测生物细胞中的Fe3+含量。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

所有的试剂均为分析纯，用到的无水CH2Cl2在CaH2中回流并蒸馏得到。无水乙腈采用色谱纯。三乙胺采用简单的蒸馏得到。

氢和碳的核磁共振图谱均采用布鲁克700 MHz核磁仪。高分辨质谱采用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL仪器。基质辅助质谱采用ultraflex TOF型仪器。吸收光谱采用TU-1901紫外光谱仪。荧光光谱采用Cary Eclips型荧光光谱仪。细胞成像实验采用蔡司LSM880共聚焦激光扫描显微仪。毒性试验采用ELX808酶标仪。

1.2 合成探针2

探针2的合成路线见Scheme 1。化合物1由文献报道的BODIPY类荧光染料经典合成方法得到[14]。探针2采用Knoevenagel缩合反应，选用吡啶-2-甲酸(4-甲酰基苯酚)酯与化合物1反应得到。

Scheme 1 Synthetic route for probe 2:わtriethyl formate and trifluoroacetic acid in CH2Cl2,triethylamine,DDQ,BF3·OEt2,r.t.;ぷ 3-formylphenyl picolinate,AcOH/piperidine,acetonitrile,reflux

探针2的合成方法：在100 mL的两颈烧瓶中，加入 0.105 6 g(0.44 mmol)化合物 1，0.199 8 g(0.88 mmol)吡啶-2-甲酸(4-甲酰基苯酚)酯，0.40 mL 无水哌啶，0.40 mL冰醋酸和50.0 mL无水乙腈。在氩气保护下，使用分水器，加热至沸，反应过程用薄层色谱(TLC)监测，至化合物1全部消失。反应结束后，冷却至室温。反应液分别用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得到粗产物。柱层析分离，展开剂用二氯甲烷，得到褐色固体，产率为39%。1H NMR(CDCl3，700 MHz)：7.47(d，J=7 Hz，2H)，7.45(d，J=21 Hz，1H)，7.21(d，J=21 Hz，1H)，7.01(s，1H)，6.83(d，J=7 Hz，2H)，6.66(s，1H),6.07(s,1H),5.46(s,1H),2.56(s,3H),2.29(s,3H),2.26(s,3H)。13CNMR(CDCl3,175 MHz)：156.77，156.00，154.58，140.85，140.48，136.44,135.00，133.70，129.40，119.03，118.49,116.83,115.87,115.46，14.97，11.58，11.54。 HR-MS(C20H20BF2N2O，[M+H]+)：计算值 353.163 6；实验值 353.163 0。

1.3 测试荧光量子产率

探针2的荧光量子产率测试条件如下，选用罗丹明6G为标准，溶解到乙醇溶液中(ФF=0.88)，浓度为1μm，激发狭缝和发射狭缝分别为5 nm，激发波长选用546 nm，荧光光谱的积分范围为550～700 nm。荧光量子产率(Yu)的计算公式为：Yu=Ys(Fu/Fs)(As/Au)(Gu2/Gs2)。Ys为罗丹明6G的荧光量子产率，Fu为探针2的荧光光谱积分面积，Fs为罗丹明6G的荧光光谱积分面积，Au为探针2在546 nm处的吸光度，As为罗丹明6G在546 nm处的吸光度，Gu为探针2在不同溶液中的折射率，Gs为罗丹明6G在乙醇溶液中的折射率。

1.4 识别金属离子的实验

将金属离子(Ca2+，Ni2+，Na+，Co2+，Cd2+，Cu2+，Mg2+，K+，Hg2+，Al3+，Fe2+)溶解到蒸馏水中，浓度为 1 mol·L-1。 Fe3+溶解到蒸馏水中，浓度为 0.2 mol·L-1。探针2溶解到甲醇和缓冲溶液的混合溶液中(V/V，1∶2)，浓度为10μmol·L-1。缓冲溶液选用醋酸与醋酸钠配制的缓冲溶剂，pH为4.00。在滴定实验中，每次取用探针 2(3 mL，10 μmol·L-1)到比色皿中，然后采用微量进样器不断加入Fe3+溶液。在选择性实验中，取用探针 2(3 mL，10 μmol·L-1)到比色皿中，然后加入60μL其他离子。

1.5 细胞成像实验

HeLa细胞由中国科学院上海生化细胞所提供。HeLa细胞在37℃和5%(V/V)CO2条件下，于DMEM培养基(12%胎牛血清和1%抗生素)中培养。HeLa细胞贴在六孔板并孵育过夜，之后用PB(pH=6.00)溶液洗3次。探针2溶解到二甲基亚砜(DMSO)溶液中并加入到HeLa细胞中一起孵育并孵育30 min。探针2在培养基中的浓度为5μmol·L-1，多余的探针2用PB(pH=6.00)溶液清洗3遍，用作细胞成像实验。同时，取用1份相同条件下的HeLa细胞，采用上述方法加入探针2，之后补加100μmol·L-1的FeCl3于培养基中孵育1 h，PB(pH=6.00)溶液洗1次，用作细胞成像实验。

2 结果与讨论

2.1 化合物1和2的光谱特性

化合物1和2在二氯甲烷溶液中的紫外可见吸收光谱图和荧光光谱图如图1所示。化合物1和2均有经典的BODIPY类荧光分子的吸收峰。探针2最大吸收峰位于573 nm，与化合物1相比，红移了66 nm。化合物2的荧光峰位于581 nm，与化合物1相比，红移了70 nm。主要原因是探针2在BODIPY母核的3-位引入对羟基苯乙烯基，增大了分子的共轭度。

图1 化合物1和2在二氯甲烷溶液中的吸收光谱(实线)和荧光光谱(虚线)Fig.1 Absorption(solid line)and fluorescence(dash line)spectra of 1 and 2 in CH2Cl2

探针2在不同溶剂中光谱性质如表1。从数据中可以看出，探针2的最大吸收峰和荧光峰没有随着溶剂极性的改变出现明显的变化规律。探针2在乙腈溶液中的最大吸收峰和发射峰的波长最短，在DMSO溶液中最大吸收峰和发射峰的波长最长。探针2在不同溶剂中的荧光量子产率变化较大，在甲醇溶液中的荧光量子产率最高，为0.90。故而测试探针2对溶液pH值和Fe3+的响应时均采用甲醇与缓冲溶液的混合溶液。

探针2在表1中的各种有机溶剂中的溶解度均良好，但不溶于水。为了选取合适的混合溶剂，测试了探针2在不同比例甲醇和水中的吸收光谱和发射光谱。探针2在纯甲醇溶液中最大吸收峰和发射峰依次位于570和585 nm，随着混合溶液中水的比例加大，最大吸收峰的位置没有改变，但是强度在下降 (图2a、b)。当混合溶液中水的比例增大到67%(V/V)，探针2的最大吸收峰和发射峰的强度变化较小；当水的比例大于67%(V/V)，探针2的最大吸收峰和发射峰的强度均有明显的下降。同时，从拍照的图片中可以明显看到，无论是日光灯下还是在365 nm紫外灯下，混合溶液中水的比例应该控制在 67%(V/V)及更小(图 2c、d)。

表1 化合物2在不同溶剂中的光谱数据Table 1 Spectroscopic properties of compound 2 in different solvents at 298 K

图2 (a)探针2在甲醇和水不同比例混合溶液中的吸收光谱图;(b)探针2在甲醇和水不同比例混合溶液中的荧光光谱图;(c)探针2在不同甲醇与水混合溶液中(0%～86%,V/V)的照片;(d)在365 nm紫外灯下探针2在不同甲醇与水混合溶液中((0%～86%,V/V)的照片Fig.2 (a)Absorption spectra of probe 2 in CH3OH-water mixed solvents;(b)Fluorescence spectra of probe 2 in different CH3OH-water mixed solvents;(c)Photographs of the probe from CH 3OH-water mixed solvents(0%～86%,V/V);(d)Photographs of probe 2 from CH3OH-water mixed solvents(0%～86%,V/V)under UV lamp of 365 nm

2.2 探针2对弱酸溶液pH值的识别

探针2的吸收光谱和荧光光谱随溶液pH值的变化曲线见图3和图4。探针2在不同pH值溶液中的吸收曲线表明，当溶液的pH≤6.00时，溶液的最大吸收峰位于570 nm并且它的强度在酸性范围内随着pH值的减小略有下降；当溶液的pH≥7.00时，溶液的最大吸收峰位于600 nm并且它的强度在中性及碱性范围内随着pH值的增大略有下降。同时详细地测试了溶液pH值在6.00～7.00范围内，当不断加入NaOH溶液调节溶液pH值时，探针2在570 nm处的吸收峰不断下降，同时在600 nm的吸收峰不断升高。同时从图片上可以清晰地看到，探针2在pH＜6.00时显示粉红色，pH值在6.00～7.00范围，由粉红色逐渐变为蓝色，pH＞7.00为蓝色。实验结果表明探针2可以作为“裸眼”pH探针。

图3 (a)在甲醇-水混合溶剂(67%,V/V)中,探针2在最大吸收峰处的吸光度随溶液pH值变化的曲线;(b)在不同pH值(6.00～7.00)下,探针2的吸收光谱变化;(c)探针2在不同pH值(1.00～14.00)下的照片Fig.3 (a)Effect of pH value on the absorption intensity of probe 2 in CH3OH-water mixed solvents(67%,V/V);(b)Absorption spectrum change of probe 2 at different pH values(6.00～7.00);(c)Photographs of probe 2 at different pH values(1.00～14.00)

图4 (a)在67%(V/V)的甲醇和水混合溶液中,探针2在585 nm处的荧光强度随溶液pH值变化的曲线;(b)在不同pH值(6.00～7.00)下探针2的荧光光谱变化;(c)在365 nm紫外灯下探针2在不同pH值(1.00～14.00)下的照片Fig.4 (a)Effect of pH value on the fluorescence intensity of probe 2 in CH3OH-water mixed solvents(67%,V/V);(b)Fluorescence spectrum change of probe 2 at different pH values(6.00～7.00);(c)Photographs of probe 2 at different pH values(1.00～14.00)under UV lamp of 365 nm

探针2的荧光曲线随溶液pH值的变化表明，当溶液的pH≤6.00时，溶液的最大发射峰位于585 nm并且发射峰的强度在酸性范围内随着pH值的减小略有下降；当溶液的pH≥7.00时，溶液的荧光峰消失。同时详细地测试了溶液pH值在6.00～7.00范围内，当不断加入NaOH溶液调节溶液pH值时，探针2在585 nm处的发射峰波长不变，强度不断下降。同时从图片上可以清晰地看到，探针2在pH＜6.00显示红色的荧光，pH值在6.00～7.00范围，红色荧光在不断消失，pH＞7.00时荧光完全消失。因此，探针2可以作为荧光探针用于测定溶液pH值。此外，利用Henderson-Hasselblad方程对滴定曲线进行拟合(图4b插图)，结果表明探针2的p Ka约为6.05。

2.3 探针2对常见金属离子识别

图5 加入各种金属离子后探针2在甲醇和缓冲溶液(1∶2,V/V,pH=4.00)的吸收光谱图 (a)和荧光光谱图 (b);在日光灯 (c)和365 nm的紫外灯 (d)下,探针2在不同金属离子中的照片Fig.5 Absorption(a)and fluorescence(b)spectra of probe 2 upon addition of different metal ions in CH3OH/Buffer(1∶2,V/V,pH=4.00)mixed solution;Photographs of probe 2 upon addition of different metal ions under sunlight(c)and UV lamp of 365 nm(d)

探针2对常见金属离子(Ca2+,Ni2+,Na+,Co2+，Cd2+，Cu2+，Mg2+，K+，Hg2+，Al3+，Fe2+，Fe3+)的选择性检测见图5。探针2溶解到甲醇和缓冲液(醋酸与醋酸钠配制的缓冲液，pH=4.00)中，分别加入各种金属离子，Fe3+的加入量为探针2的400倍，其它金属离子(Ca2+，Ni2+，Na+，Co2+，Cd2+，Cu2+，Mg2+，K+，Hg2+，Al3+，Fe2+)的加入量为探针2的2 000倍，同时测试了该溶液的吸收光谱和荧光光谱图 (图5a、b)。吸收光谱图表明，Fe3+的加入改变了探针2的吸收光谱图，最大吸收波长由570 nm变化到505 nm，蓝移65 nm；Mg2+的加入，使得探针2的吸光度略有下降；其它金属离子的加入均没有引起明显的变化。同时从照片中(图5c)也可以清晰地看到Fe3+的加入使得探针2溶液的颜色变为黄色。荧光光谱表明，Fe3+的加入改变了探针2的荧光光谱图，发射波长由585 nm变化到515 nm，蓝移70 nm；Co2+，Cu2+的加入，使得探针2的发射峰的强度略有下降；其它金属离子的加入均没有引起明显的变化。同时从照片中(图5d)也可以清晰地看到Fe3+的加入使得探针2溶液在365 nm紫外灯下显示绿色。实验结果表明，探针2对Fe3+的检测具有选择性，并且能够在溶液中“裸眼”检测出Fe3+的存在。

2.4 探针2对溶液中的铁离子的识别

探针2的吸收和荧光光谱随着Fe3+加入发生相应变化曲线见图6。吸收光谱图及动力学曲线表明，随着Fe3+的加入量的增大，探针2的吸收波长发生变化，570 nm处的吸光度在下降，505 nm处的吸光度在上升，当加入400倍的Fe3+时，505 nm处的吸光度为最大。荧光光谱图及动力学曲线表明，随着Fe3+的加入量的增大，探针2的发射波长发生变化，585 nm处的荧光峰在下降，515 nm处的荧光峰在上升，当加入160倍的Fe3+时，515 nm处的荧光强度为最大(图6d)。探针2与Fe3+的荧光动力学曲线见图 6e，采用如下公式归一化：R=1-Ii/Imax，Ii为探针2与Fe3+反应后的荧光强度，Imax为探针2未与Fe3+反应前的荧光强度。荧光反应和Fe3+浓度的拟合曲线得到线性关系为y=0.495 3x-0.017 8，相关系数为0.991 4，可以计算出探针2检测Fe3+的最低检出限为0.36 mmol·L-1。实验结果表明，探针2可以在溶液中检测Fe3+的存在，并且探针2既是比率计量型的“裸眼”探针，又是比率计量型的荧光探针。

2.5 探针2对弱酸溶液pH值及Fe3+的识别机理研究

探针2与NaOH反应前后的氢核磁谱图见图7a。探针2分子结构中的3个-CH3化学位移值分别为2.49、2.32、2.28。 探针2与NaOH反应后-CH3化学位移值为2.43、2.26、2.21。与未加入NaOH比较，化学位移值略有下降。同样，探针2与NaOH反应后苯乙烯基的化学位移值与探针2比较有较大的下降。参照文献[29]，可以推测得到探针2在碱性条件下，3-位对羟基苯乙烯基失去羟基H质子，变为氧负离子。探针2与Fe3+反应前后的质谱图见图7b。探针2的分子离子峰为352.155，探针2与Fe3+反应后的离子峰为277.123。参照文献[21]，推测出加入Fe3+后，探针2分子结构中烯烃基团断裂，氧化为羧酸基。

图6 加入不同浓度的铁离子后探针2在甲醇和缓冲溶液(1∶2,V/V,pH=4.00)的吸收光谱图(a)和荧光光谱图(c);(b)探针2在570和505 nm处吸光度随着加入不同浓度铁离子的变化曲线;(d)探针2在515和585 nm的荧光强度随着加入不同浓度铁离子的变化曲线;(e)探针2与Fe3+反应后归一化的荧光强度随Fe3+浓度变化的曲线Fig.6 Absorption(a)and fluorescence(c)spectra of probe 2 upon addition of Fe3+in mixed CH3OH/Buffer(1∶2,V/V,pH=4.00)solution;(b)Plot of absorbance vs Fe3+concentration at 505 and 570 nm;(d)Plot of fluorescence intensity vs Fe3+concentration at 515 and 585 nm;(e)Normalized fluorescence intensity of probe 2 after reacting with Fe3+as a function of Fe3+concentration

图7 (a)探针2在氘带甲醇中与NaOH反应前后的氢核磁谱图;(b)探针2与Fe3+反应前后的质谱图Fig.7 (a)1H NMR spectra of probe 2 in CD3OD before and after the addition of NaOH;(b)MSspectra of probe 2 before and after the addition of Fe3+

2.6 探针2检测细胞中铁离子

探针2在活体细胞中对Fe3+的成像见图8。37℃下，探针2在HeLa细胞中孵育30 min，用530 nm的光激发，可以看到细胞有红色荧光；用485 nm的光激发，没有看到荧光(图 8a、b)。补加 100 μmol·L-1的Fe3+到细胞中，孵育1 h，用530 nm的光激发，没有看到荧光；用485 nm的光激发，可以看到细胞有绿色荧光(图8c、d)。同时从明场和交叠场可以进一步证明探针2可以检测细胞中的铁离子。细胞质和细胞核染色强度比值较大(I2/I1＞20，图9)，表明探针2主要染色到细胞质上，细胞核染色较少。实验结果表明，探针2具有较好的渗透性，可以很好地染色到细胞质，并且能够高效地检测细胞中的铁离子含量。

图8 探针2在HeLa细胞中共聚焦荧光成像图片、明场下图片及交叠图片:激发波长为530 nm(a)和485 nm(b)下,温度为37℃时探针2在细胞中孵育30 min的图片;激发波长为530 nm(c)和485 nm(d)下,温度为37℃时细胞中补加100μmol·L-1的Fe3+孵育1 h的图片;细胞在明场下的图片(e,g);细胞在交叠下的图片(f,h)Fig.8 Confocal fluorescence,bright field images and overlay images of probe 2 in HeLa cells:Cells incubated with 5 μmol·L-1 bright field of probe 2 for 30 min at 37℃upon excitation at 530 nm(a)and 485 nm(b);Cells supplemented with 100 μmol·L-1 of Fe3+in the growth media for 1 h at 37 ℃ upon excitation at 530 nm(c)and 485 nm(d);Bright field images of cells showed in panel(e,g);Overlay images of cells showed in panel(f,h)

图9 (a)温度为37℃时探针2在HeLa细胞中孵育30 min的共聚焦荧光成像图;(b)分别单个细胞中细胞质 (1)、细胞核 (2)和细胞质 (3)所对应的荧光强度Fig.9 (a)Confocal fluorescence imaging of living HeLa cells incubated with probe 2 for 30 min at 37℃;(b)Fluorescence intensity profile across the line shown in panel A corresponding to cytoplasm(1),nuclear region(2)and cytoplasm(3)

探针2对细胞的毒性实验见图10。不同浓度(0～60μmol·L-1)的探针2孵育到细胞中，结果表明，孵育5 h后，20μmol·L-1的探针2细胞存活率达到100%，探针2浓度加到60μmol·L-1细胞存活率降到83%。孵育10 h后，20μmol·L-1的探针2细胞存活率达到100%，探针2浓度加到60μmol·L-1细胞存活率降到78%。上述结果表明，探针2浓度在0～60 μmol·L-1，孵育 10 h，都不会影响细胞的生存，说明探针2可以检测细胞中的铁离子含量。

图10 探针2对细胞毒性试验Fig.10 MTT of probe 2

3 结 论

通过改进Knoevenagel缩合反应，将对羟基苯乙烯基引入到BODIY的3-位，增加了分子的共轭度，得到了荧光探针2。探针2易溶于常见的有机溶剂，具有大的摩尔吸光系数和高荧光量子产率(＞0.60)。探针2在甲醇-水的混合溶剂中随溶液pH值的增大发生波长红移和荧光淬灭，可以作为“裸眼”探针检测弱酸溶液的pH值。并且对溶液及活体细胞中的Fe3+表现出吸收和荧光光谱的比率计量型变化，且细胞毒性低，可以应用在生物体系中Fe3+的检测。