NPM1 A型突变体对TGF-β1诱导K562细胞增殖及AKT磷酸化的影响*

吴正财 王成艳 吴香新 许昌声 林敏辉

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）为一种高度异质性疾病，其发病机制涉及多种基因改变，核仁磷酸蛋白（nucleophosmin，NPM1）突变为髓系白血病（myeloid leukemia，ML）最常见的基因突变，其NPM1 A 型突变体（NPM1 mutant A，NPM1 A）约占75%～80%［1-2］。研究证实，NPM1突变可下调抑癌蛋白ARF 的活性、增强癌蛋白c-myc 的稳定性，促进细胞的恶性增殖［3-5］；动物体内实验结果显示，NPM1 突变可导致转基因小鼠骨髓组织异常增生［6］。研究发现，NPM1 突变后可促进胞质内细胞信号分子PI3K、ARF 和NF-kappa B 等发生移位，参与调控白血病细胞的恶性增殖和抵抗凋亡［4-7］。AKT为细胞增殖的重要调控分子，在转化生长因子TGF-β1 作用下，发生磷酸化及细胞核移位，刺激下游信号分子表达，促进细胞增殖［8］。研究发现，AML患者白血病细胞过度增殖与AKT 分子磷酸化有关［9］。本研究通过体外感染携带NPM1 A 型突变体腺病病毒（Ad5－NPM1）K562细胞，观察Ad5-NPM1 对TGF-β1 诱导的K562 细胞增殖及AKT磷酸化的影响，探讨过表达NPM1突变蛋白的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 Ad5-NPM1-EGFP 腺病毒由上海吉凯基因化学技术公司构建；RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone 公司；TGF-β1 购自美国Sigma 公司；anti-NPM1 和anti-βactin 抗体及免疫印迹化学发光试剂均购自美国Santa Cruz 公司；anti-AKT 和anti-P-AKT 购自美国TSC公司；HRP 标记的Ⅱ抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；NPM1 ELISA 试剂盒购自上海Roche 公司。SW-CJ－IF 型超净工作台购自苏州苏净集团；CO2细胞培养箱购自日本Sanyo 公司；超速低温离心机Sigma-3K15 购自德国Sigma 公司；-70℃超低温冰箱DW-86L386 购自青岛海尔集团；Ⅸ70 型荧光相差倒置显微镜购自日本Olympus 公司；Mini-PROTEAN Tetra MP4 垂直电泳槽购自美国Bio-Rad 公司；DYCP-40C 型半干式碳板转印仪槽购自北京六一仪器厂。

1.1.2 细胞培养 白血病细胞株K562由福建医科大学附属协和医院血液病研究所提供，用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，于37℃，5%CO2的培养箱内培养，2～3 d 将细胞培养液移至15 mL 离心管，300 g离心，弃上清，加10%胎牛血清的RPMI 1640 培养重悬细胞，按1∶3分装培养，取3～5代细胞用于实验。

1.2 方法

1.2.1 ELISA 法测细胞上清液NPM1 蛋白含量 准备好稀释后的标准品和待测样品，按Roche NPM1 ELISA 试剂盒说明书完成操作，于450 nm 处测定OD值，并根据标准品计算待测样品浓度。

1.2.2 MTT法测细胞增殖 取3～5代K562细胞，300 g离心，0.2%FBS 1640培养基重悬细胞2×105cells/mL，接96孔培养板，每孔加入100µL细胞悬液继续培养24 h，细胞分为3 组：空白对照组（CT）、空载组（转染Ad5-vector-100）、Ad5-NPM1 组，每组3 个复孔，转染3 d 后加入TGF-β1干预24 h；干预完成后加入10µL/孔MTT（5 mg/mL），继续培养4 h，300 g离心，弃上清，加入DMSO 100µL/孔，置摇床上低速振荡10 min，于酶标仪490 nm处测定OD值。

1.2.3 Western blot法检测蛋白表达水平 取3～5代K562细胞300 g离心，0.2%FBS 1640培养基重悬细胞2×105cells/mL，均匀接种于6 孔板中，每孔加入1 mL 细胞悬液继续培养24 h，加入不同处理因素（TGF-β1 或转染NPM1 联合处理）后，反复吹打细胞培养基数次，将细胞悬液移至1.5 mL EP管，300 g离心10 min，弃上清液，加1×SDS（200µL/管）混匀，冰上静置10 min，收集混合液于EP 管中，迅速置于沸水中10 min。4℃，12 000 g离心10 min，取上清液，测定蛋白含量后，经10%SDS-PAGE，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入Ⅰ抗4℃孵育过夜。用TBST 漂洗3次，加入Ⅱ抗室温孵育1.5 h，洗膜后，滴加Luminol发光液，显影，定影，扫描，White/Ultraviolet Transilluminator 凝胶成像系统分析，蛋白表达水平以目的蛋白与β-actin光密度比值表示。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。所有计量资料以表示，多组间计量资料比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），多组间两两比较使用SNK-q检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 重组腺病毒载体Ad5-NPM1 转染K562 细胞后荧光强度的变化

荧光显微镜下观察发现，K562 细胞胞质荧光强度随重组腺病毒载体Ad5-NPM1 感染复数（MOI：30～200）增加而增强，转染第3 d后可见K562细胞胞质有大量绿色荧光（图1）。

2.2 Ad5-NPM1 转染K562 细胞（3 d）后NPM1 蛋白表达水平的变化

Ad5-NPM1转染K562细胞（3 d）后提取蛋白，进行Western blot法检测发现：空白对照组（CT）与空载组（Ad5-vector-100）之间NPM1蛋白水平无显著差异（P＞0.05）；NPM1蛋白表达水平呈Ad5-NPM1转染复数（MOI：30～100）依赖性增加，与Ad5-vector-100组相比，Ad5-NPM1-30组和Ad5-NPM1-100组NPM1蛋白表达水平均显著增加（P＜0.01），Ad5-NPM1-200组和Ad5-NPM1-100组NPM1表达水平无显著性差异（P＞0.05，图2）。后续选择Ad5-NPM1-100为实验条件。

2.3 Ad5-NPM1转染K562细胞（3天）后细胞上清液NPM1蛋白含量的变化

为进一步测定感染效率，本研究提取细胞上清液行NPM1 ELISA实验。发现空白对照组（CT）与空载组（Ad5-vector-100）NPM1蛋白含量的差异无统计学意义（P＞0.05）；K562细胞上清液的NPM1水平呈Ad-NPM1转染复数依赖性增加（r=0.92），与CT组相比，Ad-NPM1-30组和Ad-NPM1-100组的NPM1蛋白含量显著增加（P＜0.01），Ad-NPM1-200组和Ad-NPM1-100组NPM1蛋白水平的差异无统计学意义（P＞0.05，图3）。

图1 Ad5-NPM1转染K562细胞（3 d）荧光显微镜观察（物镜×10）

图2 Western blot检测Ad5-NPM1转染K562细胞（3 d）NPM1蛋白表达

图3 ELISA法测Ad5-NPM1转染K562细胞上清液NPM1蛋白含量

2.4 TGF-β1（10 ng/mL）对K562 细胞AKT、P-AKT水平的影响

Western blot 法检测结果发现，TGF-β1能够时间依赖性诱导K562细胞AKT 蛋白磷酸化，其磷酸化水平在作用30 min 后即明显增加，45 min 达到峰点，但对总AKT水平无显著影响（图4）。

2.5 Ad5-NPM1 转染对TGF-β1 诱导的K562 细胞AKT、P-AKT的影响

K562细胞转染Ad5-vector或Ad5-NPM1 3天后，TGF-β1（10 ng/mL）处理45 min，提取蛋白进行Western blot法检测。结果显示与空白对照组（CT）相比，TGFβ1刺激可显著增加K562细胞的P-AKT水平；与TGFβ1（10 ng/mL）组相比，TGF-β1+Ad5-Vector-100组PAKT水平的差异无统计学意义（P＞0.05），而TGF-β1+Ad5-NPM1-100组的P-AKT水平则显著增加（P＜0.05），各组总AKT水平未见显著差异（P＞0.05，图5）。

图4 Western blot 法检测TGF-β1（10 ng/mL）诱导K562细胞AKT、PAKT的影响

2.6 Ad5-NPM1转染对TGF-β1诱导的K562细胞增殖的影响

K562细胞转染Ad5-vector或Ad5-NPM1 3天后，TGF-β1（10 ng/mL）处理24 h，行MTT实验，结果显示空白对照组（CT）与空载组（Ad5-vector-100）间细胞增殖无显著性差异（P＞0.05）；与Ad5-vector-100组相比，TGF-β1+Ad5-vector-100 组细胞增殖显著增高（P＜0.01）；TGF-β1+Ad5-NPM1-100组细胞增殖显著高于TGF-β1+Ad5-vector-100组（P＜0.01，图6）。

图5 Western blot 法检测Ad5-NPM1 转染对TGF-β1（10 ng/mL）诱导K562细胞AKT、P-AKT的影响

3 讨论

NPM1为一种重要的核磷蛋白，其参与多种细胞生物过程。体外实验证实NPM1 突变体蛋白可下调抑癌蛋白ARF 的活性、增强癌蛋白c-myc 的稳定性，增强对细胞刺激因子反应性，促进细胞的过度增殖［4］。Falini 等［10］研究发现，在AML 患者中常伴有NPM1 突变，体外细胞实验也发现伴有NPM1 突变体白血病细胞对TGF-β1 诱导增殖能力明显增强，PI3K/AKT信号通路活性也显著升高，提示患有NPM1突变的白血病患者可能通过增强PI3K/AKT信号通路促进白血病细胞增殖效应。本研究旨在探究NPM1突变在生长因子作用下对ML 细胞株K562 增殖的影响。首先将携带NPM1 A 型突变体的腺病毒载体转染K562 细胞建立过表达NPM1 蛋白的K562 细胞株。Western blot 与ELISA 的检测结果均显示，Ad5-NPM1转染K562细胞3 d后细胞NPM1蛋白表达水平显著增加，提示通过携带NPM1A 型突变体基因腺病毒载体转染可成功建立过表达NPM1蛋白的K562细胞株。

图6 MTT 法检测Ad5-NPM1 转染（MOI=100）对TGF-β1（10 ng/mL）K562细胞增殖的影响

TGF-β1为一种重要肿瘤细胞刺激分子，其可诱导细胞增殖和分化，Hamilton 等［5］研究发现，AKT 作为细胞增殖重要调控分子，在生长因子作用下，AKT发生磷酸化，促进细胞增殖效应。本研究采用10 ng/mL的TGF-β1短时间处理K562细胞，发现TGF-β1能有效增加AKT 的磷酸化水平，结果提示在K562细胞中TGF-β1 可能通过调控AKT 磷酸化水平来诱导生长。随即检测过表达NPM1 蛋白K562 细胞株中，过表达NPM1 对TGF-β1 诱导P-AKT 的影响，发现与TGF-β1（10 ng/mL）组相比，转染Ad5-NPM1 的K562细胞能进一步增加TGF-β1（10 ng/mL）诱导的AKT磷酸化水平。MTT 结果也显示过表达NPM1 蛋白可明显促进TGF-β1诱导的K562细胞增殖。

综上所述，NPM1 A 型突变体可增强TGF-β1 对K562 细胞诱导的增殖能力，且与AKT 磷酸化水平有关。