臭氧胁迫对大豆氮磷化学计量特征的影响

武红艳，王岩，赵天宏，田荣荣，张铭，孙铭禹

沈阳农业大学农学院，辽宁 沈阳 110866

对流层臭氧（O3）是一种主要由氮氧化物和挥发性有机物经过光化学反应生成的二次污染物（Bytnerowicz et al.，2008）。在中国，随着工业化和城市化的快速发展，臭氧前体污染物（氮氧化物和挥发性有机物）排放量增加，导致 O3浓度快速增加（Feng et al.，2015）。沈阳是东北重工业城市，其夏季平均O3浓度已达到60 nmol·mol-1以上，超过敏感植物的臭氧损伤阈值 40 nmol·mol-1（王闯等，2015）。臭氧浓度升高会对植物生长发育和营养吸收产生一定的影响，例如叶片损伤，叶绿素含量降低，光合速率下降，加速其衰老（平琴等，2017），影响植物根系发育和土壤过程（Nikolova et al.，2009），从而间接影响植物对营养物质（如氮和磷）的吸收和分配（Zheng et al.，2013）。

生态化学计量学（Ecological Stoichiometry）是研究有机体内化学元素平衡和生态系统能量平衡的学科（Austin et al.，2012），主要是强调有机体内碳（C），氮（N）和磷（P）等元素间的化学计量关系（Allen et al.，2009）。氮、磷作为植物体内的主要营养元素，与植物结构及功能有密切联系，其化学计量特征能够反映植物的生长速率、养分利用效率及限制性元素（Song et al.，2014）。近年来国内外已经进行了N和P生态化学计量的研究，但主要集中在干旱、CO2浓度升高、氮沉降及施肥对植物等方面的研究。孙彩丽等（2017）研究表明，氮素添加显著提高白羊草（Bothriochloa ischaemum）地上部分N/P，干旱胁迫对白羊草地上部分N/P无显著影响。Yuan et al.（2015）的研究表明，CO2浓度增加会使植物的 N/P普遍降低。但是涉及到 O3胁迫对植物氮磷化学计量特征的研究较少，且结果较不一致。贾一磊（2017）研究表明，臭氧浓度升高使4种小麦（Triticum aestivum L.）成熟期叶片N、P浓度均增加，但不同品种间增加程度有差异；Shang et al.（2018）研究发现，臭氧浓度升高对两种克隆杨树（Populus L.）的生态化学计量特征有显著影响，其中N、P浓度显著升高，而N/P没有影响，同时对两种克隆杨树的P吸收无影响，说明杨树生长受N素限制，土壤中的有效磷足以维持其生长。因此，在全球气候变化的背景下，研究臭氧浓度升高情况对植物生态化学计量特征的影响，对预测未来生态过程和生物地球化学循环有重要作用。

大豆（Glycine max）是东北区的主产作物之一，也是对O3污染最为敏感的作物之一（Morgan et al.，2004）。本研究以“铁丰29号”大豆为试验材料，采用开顶式气室法（OTCs），分析O3浓度升高对大豆根、茎、叶N、P化学计量特征及养分限制情况，有助于了解臭氧浓度升高条件下大豆N、P分配格局及养分限制状况，为提高大豆生产力和农业可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验以大豆栽培品种“铁丰 29号”为试验材料，该品种的生育期为130－133 d，适合在中等或中等以上肥力的土壤中种植。本研究利用开顶室气室（OTCs）对大豆进行熏蒸试验，主要设备包括OTCs（横截面为正八边形，边长1.15 m，高2.4 m，玻璃室壁）、臭氧发生器（BGY-Q8，北理国科，中国）、臭氧传感器（S-900，Aeroqual Ltd.，新西兰）、温湿度传感器以及数据分析与自动控制充气系统。在整个试验期间，控制气室内实际气体浓度稳定。

1.2 试验地点

试验在中国科学院沈阳农田生态系统国家野外科学观测研究站进行。研究站位于沈阳市苏家屯区十里河镇（41°31′N，123°24′E），年平均气温为 7－8 ℃，大于 10 ℃的年平均积温为 3100－3400 ℃，年均降雨量为700 mm，无霜期为147－164 d，主要土壤类型为草甸棕壤。土壤（0－20 cm）全 N 1.18 g·kg-1，全 P 0.51 g·kg-1，全 K 23.17 g·kg-1，有机质 12.03 g·kg-1。

1.3 试验设计

试验在中国科学院沈阳野外农田生态系统生态站进行，室内试验在沈阳农业大学生态学实验室进行。试验设3个处理：CK处理（对照，环境浓度），T1 处理[O3浓度为(80±10) nmol·mol-1]和 T2处理[O3浓度为(110±10) nmol·mol-1]。采用盆栽试验，PVC桶高30 cm，直径34 cm，每个气室20桶。2017年5月10日播种于气室内，每个气室大约120株（相当于18万株/hm2），大豆出苗20 d后开始进行熏蒸试验，每天熏蒸8 h（9:00－17:00）。试验期间水分、肥料均匀一致，无病虫害及杂草等限制因素。分别于大豆分枝期（6月 26日）、开花期（7月18日）和结荚期（8月10日）取样，8月30日停止通气直至成熟。在每个生育时期每个处理分别随机采集植株样品3株，连同地下茎、根系一同挖出，用保鲜膜将其包好防止失水，带回实验室测定，每个气室内重复3次。

1.4 测定指标及方法

每次采集完大豆植株样品，立即冲洗干净，用吸水纸吸干植株表面多余水分，按照根、茎、叶片剪开，然后分别将植株样品剪碎，放入烘箱，于105 ℃下杀青30 min，然后于80 ℃下烘干至恒重；将植株样品磨碎并过0.25 mm筛，使用浓H2SO4碳化，H2O2高温消煮，采用凯氏定氮法测定全氮含量，钼锑抗比色法测定全磷含量（鲍士旦，2005）。

1.5 实验数据处理

运用Microsoft Excel 2010软件处理数据，采用SPSS17.0软件中的双因素方差分析（Two-way ANOVA）检验臭氧胁迫程度、胁迫时间及其交互作用对大豆各器官N、P含量及比值的影响，对各器官 N、P含量及比值之间的关系进行 Pearson相关性分析，并采用单因素方差分析（One-way ANOVA）分析不同胁迫程度、不同胁迫时间以及不同器官间N、P含量及比值的差异，结合Duncan检验法进行多重比较。各器官N、P含量及比值的变异系数=标准差/平均值×100%，采用最小显著差异法（LSD）进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 臭氧胁迫对大豆N、P含量及比值的影响

由图1可知，臭氧胁迫强度与生长时期对大豆根、茎和叶N含量均存在显著交互作用（P＜0.05）。随着生育期的延长，根N含量在CK和T2处理中表现为先上升后下降趋势，T1处理呈逐渐下降的趋势；茎N含量在CK处理下逐渐下降，T1处理先下降后上升，T2处理趋势与T1处理相反；叶N含量在CK和T1处理下呈先上升后下降的趋势，T2处理逐渐下降。随着臭氧浓度的升高，根N含量在分枝期呈先升高后降低的趋势，T1和T2处理分别比CK处理高34.06%和15.22%，差异达显著水平（P＜0.05），开花期呈先降低后升高的趋势，T1处理比CK处理低7.13%，差异达显著水平（P＜0.05），T2处理比 CK处理高 17.37%，差异达显著水平（P＜0.05），结荚期呈逐渐上升的趋势，T1和T2处理显著大于CK处理，整个生育期各处理间均存在显著差异（P＜0.05）；茎 N含量在分枝期和开花期呈逐渐升高的趋势，结荚期呈先升高后降低的趋势，3个时期均为T1和T2处理显著大于CK处理（P＜0.05）；叶片 N含量在分枝期逐渐升高，T2处理比CK处理高20.77%，差异达显著水平（P＜0.05），开花期呈先升高后降低，T1和T2处理分别比CK处理高10.47%和5.19%，差异达显著水平（P＜0.05），结荚期逐渐降低，T1和T2处理分别比CK处理高5.39%和17.03%，差异达显著水平（P＜0.05）。

图1 臭氧胁迫下大豆N含量的变化Fig. 1 Nitrogen content of soybean in different ozone stress treatments

图2 臭氧胁迫下大豆P含量的变化Fig. 2 Phosphorus content of soybean in different ozone stress treatments

由图2可知，臭氧胁迫程度与生长时期对大豆根、茎和叶P含量均存在显著交互作用（P＜0.05）。随着生育期的延长，根P含量在CK处理中呈先升高后降低，T1和T2处理均先降低后升高；茎P含量在各处理中均逐渐降低；叶P含量在CK和T1处理中先降低后升高，T2处理先升高后降低。随着臭氧浓度升高，根P含量在分枝期先升高后降低，T1和T2处理分别比CK处理高29.56%和24.07%，差异达显著水平（P＜0.05），开花期先降低后升高，T1处理比 CK处理低 15.96%，差异达显著水平（P＜0.05），T1和 T2处理间存在显著差异（P＜0.05），结荚期逐渐升高，T1处理和T2处理均显著高于CK处理（P＜0.05）；茎 P含量在整个生育期均呈逐渐升高的趋势，分枝期和结荚期T1处理和T2处理显著高于CK处理（P＜0.05），各处理间均存在显著差异（P＜0.05），开花期 T2处理显著高于 CK 处理30.22%（P＜0.05），T1和T2处理间存在显著差异；叶P含量在分枝期逐渐降低，T2处理比CK处理低25.10%，差异达显著水平（P＜0.05），T1和 T2处理间存在显著差异，开花期逐渐升高，T2处理显著高于 CK处理，结荚期先升高后降低，T2处理比CK处理低11.37%，差异达显著水平（P＜0.05），各处理间存在显著差异（P＜0.05）。

图3 臭氧胁迫下大豆N、P比值的变化Fig. 3 N/P of soybean in different ozone stress treatments in different drought stress treatments

由图3可知，臭氧胁迫程度与生长时期对大豆根、茎和叶 N/P均存在显著交互作用（P＜0.05）。随着生育期的延长，根N/P在CK和T1处理下均逐渐降低，T2处理先升高后降低；茎N/P在CK和T1处理下均逐渐升高，T2处理先升高后降低；叶片N/P在CK和T1处理下先升高后降低，T2处理逐渐降低。随着臭氧浓度升高，根N/P在分枝期先升高后降低，T2处理显著低于CK处理（P＜0.05），T1和T2处理间存在显著差异（P＜0.05），开花期逐渐升高，T1和T2处理显著高于CK处理（P＜0.05），结荚期逐渐升高，T2处理显著高于 CK处理，T1和T2处理间存在显著差异（P＜0.05）；茎N/P在分枝期和结荚期均先升高后降低，均为 T1处理显著高于CK处理（P＜0.05），结荚期T1处理和T2处理间存在显著差异（P＜0.05），开花期逐渐升高，T1和T2处理显著高于CK处理（P＜0.05）；叶N/P在分枝期逐渐升高，T2处理显著高于 CK处理（P＜0.05），开花期先升高后降低，T1与T2处理间存在显著差异（P＜0.05），结荚期先降低后升高，T1和T2处理显著低于CK处理（P＜0.05）。

2.2 大豆不同器官N、P含量及其比值的相关关系

由表1可知，大豆各器官之间N、P含量和N/P的相关关系不同。根、茎、叶N含量两两之间相关性均不显著，茎P含量与根P含量间呈显著正相关，茎P含量与根N含量间呈显著正相关，根和茎的N与P含量之间呈显著正相关，根和叶的N/P与N含量之间呈显著正相关，各器官N/P与P含量相关性不显著。

2.3 臭氧胁迫下大豆不同器官N、P含量及比值的变异特征。

由表2可知，大豆N、P含量和N/P在各器官中的分布规律不同。N含量变化范围为 7.83－36.82 mg·g-1，表现为叶＞根＞茎，各器官中存在显著差异（P＜0.05）；P含量变化范围为 1.47－3.06 mg·g-1，各器官中无显著差异；N/P变化范围为4.40－16.85 mg·g-1，表现为叶＞根＞茎。各器官N含量变异系数为12.59%－22.88%，表现为茎＞根＞叶；P含量变异系数为11.26%－19.77%，各器官中变异程度相似；N/P变异系数为4.40%－16.85%，表现为叶＞根＞茎。根和茎N含量的变异系数大于P含量的变异系数，叶中N含量的变异系数和P含量的变异系数相近。

3 讨论

3.1 臭氧胁迫下大豆N、P含量及其比值的变化

关于臭氧浓度升高对植物氮磷含量的影响已有相关报道，但结果不尽相同。研究表明，臭氧浓度升高使植物营养元素含量增加（Zhuang et al.，2016）。也有研究表明，臭氧浓度升高使叶片N含量显著升高，而根和茎N含量没有显著变化（Shang et al.，2018）。本研究发现，110 nmol·mol-1对大豆体内N含量影响显著，但不同器官和不同生育期变化规律不一致。大豆根、茎、叶N含量在生育前期（分枝期和开花期）大于生育后期（结荚期），这是在生育前期大豆处于营养生长阶段，大豆体内的物质处于积累时期，生长速率较快，细胞分裂也较快，需要更多的蛋白质来支持，生育后期环境温度升高，植物代谢率升高，使得植物体内的碳水化合物增多，生物量也快速积累，营养元素受到稀释（刘洋等，2013），从而使生育后期大豆体内根、茎、叶N含量降低。臭氧浓度升高使根在开花期T1处理和叶片结荚期 N含量显著降低，其余时期和处理下 N含量均有不同程度的显著性增加，表明在臭氧胁迫下，大豆会对其产生一种适应，通过增加N含量来提高植物对臭氧的防御能力（Yu et al.，2016），高浓度的N可以通过改变叶片的转换机制从而提高植物的适应能力，而低浓度的N降低了叶片的修复和防御功能。Dumont et al.（2014）研究表明，植物本身通过能量和抗氧化剂可以使氨基酸转移，进一步能减弱臭氧对植物的负面影响。同时根系是植物吸收水分和养分的主要器官，茎秆中的 N含量与其代谢速率密切相关（Reich et al.，2008），其大部分用于水分和养分的同化、运输及储藏等生理功能，叶片N含量增加有助于提高植物在逆境情况下的防御能力和修复能力，进而提高光合作用；而在结荚期，臭氧胁迫使叶片N含量显著降低，此结果与陈娟等（2011）研究结果一致，这是由于叶片是光合作用的主要器官，生育后期臭氧浓度升高加速了叶片的衰老，使叶片光合作用降低，从而使叶片N含量降低（Shang et al.，2018）。

表1 大豆不同器官N、P含量及比值的相关系数Table 1 Correlation coefficients among nitrogen, phosphorus content and their ratio of soybean in different organs

表2 大豆N、P含量及比值在各器官的分配特征Table 2 Nitrogen, phosphorus content and their ratio of soybean in different organs

研究表明，臭氧浓度升高使杨树 P含量增加（Shang et al.，2018）。陈娟等（2011）研究发现臭氧浓度升高使小麦各生育期P累积量明显降低，成熟期的叶部P质量分数降低，而籽粒P质量分数却有所增加。Piikki et al.（2006）研究认为，2倍大气臭氧浓度对土豆（Solanum tuberosum L.）块茎中的P含量无显著影响。本研究发现，大豆在对照处理下根P含量在分枝期和开花期大于结荚期，而臭氧浓度升高处理下根P含量在分枝期和结荚期大于开花期，说明大豆吸收P主要在开花期，根是营养吸收的主要通道，而臭氧浓度升高对大豆造成伤害，抑制大豆同化物向根部运输，使得开花期大豆根P含量降低；茎P含量随着生育期延长逐渐降低，这是因为茎是连接叶片和根的中间体，对营养吸收很重要，在生育前期大豆处于营养生长阶段，体内P含量较多，而生育后期环境温度逐渐升高，植物代谢率升高，使得植物体内的光合产物增多，营养元素受到稀释，最终P含量随着生育期的延长逐渐降低；叶片在对照和较高臭氧浓度下分枝期和结荚期P含量大于开花期，而高浓度下开花期P含量最高，说明在开花期，低浓度臭氧胁迫会降低叶片的修复能力，抑制叶片进行光合作用，使叶片P含量降低，而高浓度臭氧会使大豆产生适应，利用自身的自我修复功能，提高光合作用，最终开花期叶片P含量提高。臭氧浓度升高使大豆根、茎、叶P含量表现出不同程度的明显增加趋势，这与 Shang et al.（2018）研究结果相似，P在植物体内参与光合作用、淀粉合成、碳水化合物代谢等一系列的生理过程，当臭氧浓度升高时，大豆生长受到限制，而大豆为了适应臭氧环境，会对营养元素进行选择性吸收、物质转化以及传输来增加大豆对 P素的吸收与存储；但在开花期根系 P含量显著下降，说明臭氧浓度升高对大豆造成伤害，影响植物体内营养元素的运输，而根是养分传输的主要通道，从而使根系P含量显著降低，叶片P含量在分枝期和结荚期T2处理下显著降低，这是高浓度臭氧抑制了大豆生长，使大豆叶片受到损伤，光合作用降低，进一步使P含量降低。

生态化学计量学的一个重要应用理论表明，根据植物叶片的 N∶P可以作为判断环境因素对植物生长的养分供应情况的重要指标（曾德慧等，2005）。Koerselman（1996）通过对沼泽、湿草地和欧石楠（Erica）荒原等生态系统的研究表明，植物体内N/P小于14时，植物生长受N限制，植物组织N/P大于16时，植物生长受P限制，而当植物体内N/P介于14和16之间时，植物生长受N和P共同限制，这个理论被广泛应用于生态系统限制因子的判断。本研究中，臭氧浓度升高使根、茎N/P增加，但都小于14，说明随着臭氧浓度的升高，生长受N元素的限制作用减弱，这可能是臭氧浓度升高影响了土壤N、P含量，植物就会通过增加N含量来提高适应环境的能力，而臭氧抑制了大豆的生长，导致体内P含量降低，所以N/P增加。臭氧浓度升高使分枝期叶片 N/P逐渐增加，CK和 T1处理N/P＜14，T2处理N/P＞16，开花期叶片CK和T1处理 14＜N/P＜16，T2处理 N/P＜14，说明臭氧浓度升高加强了分枝期P素和开花期N素对大豆叶片生长的限制；结荚期叶片N/P降低，N/P＜14，说明随着臭氧浓度的升高，叶片生长受N元素的限制作用加强，这可能是臭氧浓度升高使土壤N、P有效性降低，从而影响光合作用，以及大豆的固氮能力下降，而植物为了适应环境就会在吸收、同化和运输等方面增加对N素的消耗，同时臭氧抑制了大豆生长以及生育后期叶片衰老，导致对P的消耗降低，所以N/P下降。

3.2 臭氧胁迫对大豆不同器官N、P含量及比值相关关系的影响

N、P作为植物生长的限制因素，对植物各器官N、P含量及比值进行相关性分析，可以全面了解植物对环境的适应机制（Yuan et al.，2011）。本研究表明，大豆在臭氧胁迫下，大豆各器官间的N含量彼此之间相关不显著，而根和茎的P含量之间呈显著正相关，说明大豆在臭氧胁迫下，根和茎间的P存在较强的协变性，P在根和茎中彼此协调适应环境。研究还发现根和叶的N/P与N含量之间也呈正相关显著，这也进一步说明臭氧胁迫使大豆在生长过程中根和叶受N的限制作用较强；茎P含量与根N含量间呈正显著相关，因为P是合成富含N的蛋白质rRNA的主要成分（Agren，2008），而茎又是连接叶片和根的重要营养传输器官（Zhao et al.，2016）。本研究中，根和茎中的N和P含量之间有正显著相关，而叶片中N含量和P含量之间相关不显著，这与平川（2014）研究结果不同，这可能是因为本试验中存在某一种元素缺乏或供应太多的现象，使得叶片之间N、P的失衡，也有可能是本实验的研究手段与前人不同，以及试验过程中温度与土壤等方面存在差异。本试验采用盆栽试验，严格控制试验期间的水分和肥料，使其均匀一致，得出结果说明臭氧浓度升高使大豆各器官N、P元素呈现不同的变化趋势，导致根系和茎秆中N和P元素呈相关显著，而叶片中N、P元素之间相关不显著。

3.3 大豆不同器官N、P含量及比值的变异特征对臭氧胁迫的响应

根、茎、叶作为植物体内不同的营养器官，因其结构功能的不同，各器官中的N、P含量也不同，所以同一植物不同器官的N、P含量和N/P也不同（贺合亮等，2017）。本研究发现，臭氧胁迫下大豆N含量和N/P在各器官中的顺序为叶＞根＞茎，P含量在各器官中无显著差异，这可能是叶片和细根分别是植物体内的同化器官和吸收器官，其N、P含量通常较高（印婧婧等，2009），而臭氧浓度升高使茎P含量显著升高，导致P含量在各器官中无显著差异。本研究还发现，臭氧浓度升高各器官 N含量的变异系数为12.59%－22.88%，P含量变异系数为11.26%－19.77%，说明臭氧胁迫对大豆N、P的吸收影响程度不同，而且在不同器官中的变异性也不同。N在根和茎中的变异程度大于P，叶中N和P变异性相似。臭氧胁迫使N在不同器官中的变异程度为茎＞根＞叶，说明茎秆对臭氧胁迫最敏感，臭氧严重影响了其对营养物质的传输和吸收等功能。

4 结论

综上所述，臭氧浓度升高影响大豆各器官N分配，N供给叶片多于根系，供给茎秆最少，而P在各器官中的供给无显著差异。随着臭氧浓度升高和大豆生育期的延长，大豆各器官N/P值小于14，说明大豆生长主要受N限制。研究结果可为近地层臭氧浓度升高条件下，合理施用氮（磷）肥以提高大豆生产力提供理论依据。