狐尾藻乙酸乙酯萃取部位总黄酮含量测定与抗氧化活性研究

陈春雅，毛玉玲，李泽宁，许益迪，潘奇献，徐润生

（浙江农林大学暨阳学院，浙江 绍兴 311800）

0 前言

藻类是一种非常重要的植物资源。分布广泛，成本低廉。不仅可以改善环境，而且广泛应用于医药、功能材料、合成工业等领域[1]。已有文献报道目前用于食用的淡水藻类几乎都具有一定的药用价值。从藻类植物中提取的黄酮类物质又称生物类黄酮，泛指两个苯环（A-环和B-环）通过中央三碳键相互连接而成的一系列C6-C3-C6化合物。主要是指以2-苯基色原酮为母核的化合物。天然的生物类黄酮多为其基本结构的衍生物，多以糖苷形式存在。有防血栓、保护心脑血管作用，抗肿瘤、消炎抑菌；解除醇中毒、保肝护肝；清热解毒、祛风湿、强筋骨；调节免疫力等作用[2]。藻类资源的开发利用具有前瞻性的意义。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

本次研究所用试剂均为分析纯。

仪器：UV-2000紫外可见分光光度，AL104电子天平。

1.2 提取与浓缩

取干燥狐尾藻340 g，剪碎，用95%的乙醇提取三次，料液比为1∶9。将提取液进行减压抽滤。通过真空减压浓缩装置，在旋转蒸发仪上旋转蒸发得到8.2 g的墨绿色的浸膏。

浸膏在超声波作用下分散到适量的水中，用沸程60℃～90℃石油醚进行反复萃取，到石油醚层溶液颜色近为无色为止。合并石油醚萃取液，浓缩后得石油醚部位。

石油醚萃取后的水相用乙酸乙酯萃取，有机萃取液与水相体积比为3∶1，至乙酸乙酯层溶液颜色近为无色为止。合并乙酸乙酯萃取液，浓缩后得乙酸乙酯部位浸膏6.2 g。

1.3 分离

乙酸乙酯萃取部位，旋蒸成干粉。进行硅胶（200～300目）柱色谱分离，采用湿法装柱。以石油醚、乙酸乙酯按极性递增进行梯度洗脱。每100 mL收集一份，通过TLC检识，合并相同流分。

1.4 总黄酮定性鉴别

通过盐酸镁粉反应定性检测是否含有黄酮类化合物，采用1-萘酚试剂检测是否含有黄酮苷。观察样品溶液变色情况，观察1-萘酚反应结果是否为阳性。

1.5 总黄酮含量测定

本次实验总黄酮含量的测定采用Al（NO3）3-Na（NO）-NaOH比色法，在510 nm处进行吸光度值测定。此法利用显色反应可避开其他成分的干扰。以芦丁作对照品通过标准曲线的绘制测得总黄酮含量。

（1）精密称取0.0017 g芦丁对照品，用70%的乙醇将其进行溶解，并且使用10 mL容量瓶对其进行定容，配制成为0.17 mg·mL-1浓度的对照品溶液。

（2）精密吸取芦丁标准溶液 0 mL、0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL 于 10 mL 容量瓶中，分别加入5 mL的70%乙醇溶液，再加入1 mL的5%亚硝酸钠溶液，摇匀后静置6 min，然后加入 1 mL的10%硝酸铝溶液，摇匀后放置6 min，最后加入3 mL的4%氢氧化钠溶液，用70%乙醇定容至10 mL，摇匀后静置15 min。把没有添加任何标准液的试管作为空白对照，依照上述方法进行配置，取洁净的比色皿将上述试液倒入，并且在510 nm波长处测定其吸光度值。以吸光度值A为纵坐标，以对照品溶液浓度c（mg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线。

（3）取黄酮类化合物浸膏，用电子天平称取2.000 g，再分别用70%的乙醇浸泡在锥形瓶内，并吸取一定量的样品溶液于10 ml锥形瓶中，按上述方法于510 nm处测定样品吸光度值重复三次，按标准曲线的回归方程计算出各个样品的总黄酮含量取平均值。总黄酮含量用芦丁当量RE（Rutin equivalent）表示。

1.6 抗氧化活性的测定

1.6.1 清除DPPH自由基能力的测定

图1 芦丁标准曲线

称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.004 mg/mL的DPPH溶液。分别取2 mL不同浓度的样品溶液，加入2 mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30 min后，5000 r/min离心10 min。取上清液于517 nm处测吸光值。用Ve作为阳性对照。

1.6.2 测定活性物质对羟自由基的清除率

采用Fenton试剂[3]：过氧化氢/亚铁盐。H2O2与亚铁离子反应生成·OH自由基一般存活时间比较短，具有较高的反应活性。当在反应体系中添加水杨酸，便能快速地捕捉·OH而产生紫色化合物（2，3-二羟基苯甲酸，该有色化合物在510 nm处有较大吸收峰，测其吸光度可表示羟自由基（·OH）的多少，吸光度与羟白由基（·OH）的量成正比。反应体系中若加入羟自由基（·OH）清除剂后，被氧化的水杨酸减少则体系颜色变浅甚至消失，吸光度变小。

2 结果与讨论

2.1 总黄酮定性鉴别结果

通过盐酸-镁粉定性实验发现样品溶液即刻变成橙红色，α-1萘酚实验结果显示为阳性，说明有样品中含有黄酮类化合物。

2.2 总黄酮含量测定结果

按照样品总黄酮含量测定方法对样品吸光度值进行测定，记录数值。

含量计算方程如下所示：

测试结果如表1。

表1 总黄酮含量

由上述数据可知狐尾藻乙酸乙酯部位总黄酮含量较高，具有很好的开发价值。目前的研究认为紫外辐射、高光强、低温、干旱、营养缺乏、高浓度CO2等因素均可能促进黄酮的合成[4]，通过进一步实验，获得黄酮含量较高的狐尾藻具有十分重要的意义。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH抗氧化活性分析

DPPH自由基在517 nm波长附近有最大吸收峰，当 DPPH自由基与抗氧化剂反应后，517 nm波长处的吸收值 降低，其降低的程度与接收的电子（抗氧化剂清除自由基活性）呈定量关系，反应进程很容易通过分光光度计监测。DPPH自由基清除计算公式一般为：

计算结果如表2所示。

表2 DPPH清除率

由表2数据可知，在一定浓度范围时（0.01～0.2 mg/mL），样品显示出比对照品Ve更好的抗氧化效果。

2.3.2 羟基自由基抗氧化活性分析

羟基自由基清除率所用公式如下：

表3 样品清除·OH自由基效果

由以上数据可知：浓度在0～0.2 mg/mL时，样品具有较好的清除效果，即具有较好的抗氧化活性。

2.4 讨论

狐尾藻乙酸乙酯部位中具有较高的总黄酮含量，在DPPH抗氧化活性分析及羟基自由基抗氧化活性分析结果中均体现出良好的清除自由基能力，即良好的抗氧化效果。

许多重要生命现象和疾病都与自由基有着直接或间接关系[5]。狐尾藻作为一种资源丰富，繁殖力强的植物，在治理污水、改善水域环境等方面具有良好的作用，而从另一个角度观察，其本身所具有的开发价值远远不止如此，它所蕴含的有机物潜力是巨大的，对其开发利用在多种领域具有十分重要的意义。我们不仅发现和拓宽了它的市场价值，也为以后的科学研究提供基础。