不同杂草防除模式对大葱产量及根际土壤生物学性状的影响

王帅帅 ，吴人敏，张传进，杨尚东, 2*

( 1. 广西大学农学院，广西 南宁 530004；2. 广西农业科学院广西甘蔗遗传改良重点实验室，广西 南宁 530007)

【研究意义】杂草具有数量大、抗逆性强、生长迅速等特点，不仅与农作物争夺有限的土壤肥力与光照，抑制作物的生长和发育，还会造成病虫害的发生与蔓延，对农业生产产生严重危害[1-2]。目前，防除杂草的方法主要有人工除草、覆盖地膜和使用化学除草剂等。其中，以聚乙烯烃类为原料的地膜在使用后会大量残留在土壤中，极易形成持久性污染，对农业可持续发展构成严重威胁[3]。化学除草剂亦会长时间地残留在土壤中，影响农作物产量、品质与食品安全[4]。因此，研究杂草生态防除模式对保护生态环境和提高作物产量具有重要意义。【前人研究进展】土壤微生物在农业生态系统中起着极其重要的作用[5]，土壤微生物群落结构对外界环境条件的变化非常敏感，可以反映环境变化和生态学功能[6]。王栋等[7]研究了水稻覆草旱作和免耕覆草旱作对稻田土壤理化性质和生物学性质的影响，结果发现与常规方法相比，免耕覆草旱作可以显著提高土壤有机质、全氮、碱解氮和土壤基础呼吸。谢驾阳等[8]研究了覆草对土壤有机碳氮和生物活性的影响，结果表明覆草能增加土壤有机碳氮的易矿化组分，提高土壤有机质的生物有效性。严奉君等[9]发现覆盖能够有效促进杂交稻根系的生长，增加干物质与氮素积累以及提高氮肥利用效率。【本研究切入点】有关杂草防除的研究主要集中于地上部分杂草防除效果方面，基于传统的生物学分析方法与高通量测序技术，探究不同杂草防除模式对大葱根际土壤生物学性状的影响的研究尚鲜见报道。【拟解决的关键问题】筛选最佳的杂草防除方法，为建立有效的杂草生态防除模式提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况及供试材料

试验于2017年11月至2018年4月在广西大学农学院蔬菜生产基地(东经108°18′，北纬22°51.2′)进行。大葱品种为“揽胜”(购自上海惠和种业公司)；覆盖木糠购于南宁市白苍岭农贸市场。试验地土壤类型为赤红壤，土壤pH 5.71，有机质含量8.42 g·kg-1、全氮0.51 g·kg-1、全磷0.67 g·kg-1、全钾7.21 g·kg-1、碱解氮13.17 mg·kg-1、速效磷0.59 mg·kg-1、速效钾80.6 mg·kg-1。

1.2 试验设计

试验设3个处理，分别为不除草(CK)、人工除草(T1)和木糠覆盖(T2)，每个处理3次重复，随机区组排列，共9小区，每个小区面积15.0 m2(2.5 m×6.0 m)。施肥、灌溉和病虫害防治均按常规方法相同管理。

1.3 样品采集

大葱定植80 d进入采收期后采集土壤样品。每个处理小区随机选取5株，连根拔起，依据抖根法[10]采集根际土壤并用无菌袋收集。每份土壤样品分为2部分，一部分过10目筛后置于4 ℃冰箱保存，用于土壤生物学性状分析；另一部分置于-80 ℃冰箱保存，用于细菌多样性分析。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 产量估算 大葱产量的估算采用常规计算法，收获3个处理相应的大葱，称重计算单位平方面积大葱产量，以单位面积产量估算每公顷产量。

1.4.2 生物学性状分析 利用梯度稀释平板法测定可培养微生物数量[11]。分别采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基和高氏一号琼脂培养基培养可培养细菌、可培养真菌和可培养放线菌。

参考李振高[12]以及赵久成[13]稍加改良的实验方法测定β-葡糖苷酶、氨肽酶和磷酸酶，分别采用氯仿熏蒸提取—容量分析法、氯仿熏蒸提取—茚三酮比色法和氯仿熏蒸提取—磷钼蓝比色法测定土壤中微生物生物量碳、氮和磷[14]。

土壤细菌群落结构分析由上海美吉生物医药科技有限公司测序完成。测序具体流程：DNA抽提和PCR扩增：根据E.Z.N.A.®soil试剂盒 (Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)说明书进行总DNA抽提，使用NanoDrop2000检测DNA浓度和纯度，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。用338F和806R引物对V3-V4可变区进行PCR扩增。 Illumina Miseq测序：回收PCR产物(2 %琼脂糖凝胶)→纯化(Extraction Kit)→Tris-HCl洗脱→电泳检测→检测定量(QuantiFluorTM-ST)→构建PE 2*300的文库。构建文库的步骤如下：①连接“Y”字形连接器；②用磁珠过滤自连接片段；③通过PCR扩增文库模板；④氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用Illumina Miseq测序公司MiseqPE300平台进行测序(上海美吉生物制药有限公司)。原始数据上传到NCBI数据库进行比较。

ACE指数、Chao指数、Simpson指数和Hiep指数的计算方法和结果均来自上海美吉生物医药科技有限公司I-sanger云数据分析平台(www.majorbio.com)。具体公式如下：

Chao：

其中，Schao1:估计的OTU数；Sobs:实际观测到的OTU数；n1:只含有1条序列的OTU数目；n2:只含有2条序列的OTU数目。

ACE：

其中，

ni:含有i条序列的OTU数目；

Srare:含有“abund”条序列或者少于“abund”的OTU数目；

Sabund:多于“abund”条序列的OTU数目；

abund :“优势”OTU的阈值，默认为10。

Simpson：

其中，Sobs:实际观测到的OTU数目；ni:第i个OTU所含的序列数；N: 所有的序列数。

1.5 统计分析

采用Excel 2003和SPSS 18.0统计软件进行试验数据统计分析，并利用上海美吉生物医药科技有限公司的I-sanger云数据分析平台进行在线数据分析，构建细菌群落柱形图和多样性分析，探究不同杂草防除模式对大葱根际土壤肥力与健康状况的影响。

2 结果与分析

2.1 不同杂草防除模式对大葱产量及根际土壤生物学性状的影响

2.1.1 不同杂草防除模式对大葱产量和根际土壤可培养微生物数量的影响 由表1可知，处理T2的大葱产量显著高于CK和处理T1(P<0.05，下同)，分别增产了6.5 %和8.0 %，处理T1和CK间差异不显著(P>0.05，下同)；处理T2大葱根际土壤中可培养细菌、真菌数量与CK相比分别增加了20.8 %、33.3 %，均达显著差异水平，但处理T1和T2之间可培养微生物(细菌、真菌和放线菌)数量差异未达显著水平。此外，处理T1与CK相比，可培养细菌、真菌和放线菌数量虽呈增加趋势，但两处理之间差异并未达显著水平。上述结果表明：与CK相比，处理T2显著提高了大葱产量和根际土壤中可培养细菌和真菌数量，但处理T1相应的影响效果不显著。

2.1.2 不同杂草防除模式对大葱根际土壤中涉及C、N和P循环相关酶活性的影响 由表2可知，与对照相比，除磷酸酶活性外，处理T2显著提高了大葱根际土壤中β-葡糖苷酶和氨肽酶的活性，分别提高了14.4 %和6.89 %。但处理T1仅显著提高了大葱根际土壤中β-葡糖苷酶的活性，氨肽酶和磷酸酶活性与对照之间无显著差异。这一结果表明：处理T2比T1更有助于改善大葱根际土壤中β-葡糖苷酶和氨肽酶的活性。

2.1.3 不同杂草防除模式对大葱根际土壤微生物生物量C、N和P的影响 土壤微生物生物量的多少及其变化是土壤肥力高低及其肥力变化的重要依据之一[15-16]。由表3可知，与对照相比，除微生物生物量磷外，处理T2显著提高了大葱根际土壤中微生物生物碳和氮，分别提高了3.81和1.37倍，处理T1对土壤微生物生物量的影响呈现与处理T2相似的变化趋势，该模式对微生物生物量碳和氮的提升效果分别为对照的3.47和1.25倍，与处理T2一样均显著高于对照，而且处理T2和T1之间无显著差异。此外，微生物生物量磷在3个处理中均无显著差异。结果表明：无论是处理T2亦或是处理T1均有助于提高或保持大葱根际土壤的微生物生物量碳、氮和磷，有利于提高和保持大葱根际的土壤肥力。

表1 不同杂草防除模式对大葱产量及根际土壤可培养微生物数量的影响

注：同列数据后不同小写字母表示差异达显著水平(P<0. 05)，下同。

Note：Values followed by different lowercase letters in the same column are significantly different at 0.05 level. The same as below.

表2不同杂草防除模式对大葱根际土壤酶活性活性的影响

Table 2 Effects of different mulching treatments on soil enzyme activities in rhizosphere of scallion

(nmol·g-1·min-1, 30 ℃)

表3 不同杂草防除模式对大葱根际土壤微生物量碳、氮和磷的影响

2.2 基于高通量测序的大葱根际土壤细菌多样性分析

2.2.1 根际土壤细菌的Alpha多样性分析 由表4可知，基于高通量测序技术，3个处理样品得到的序列数均在3万条之上，3个样品中产生的OTU总数量为2094个。其中CK、处理T1和T2分别为1937、1951和1981个。其中OTU数量最多的组合为处理T2，为1981个，最少的是CK，为1937个；本次研究获得的细菌群落共33个门，75个纲，155个目，283个科，502个属，958个种。在相似度97 %的分类水平下，基于I-sanger云数据分析平台计算属水平不同杂草防除模式下，大葱根际土壤中细菌的丰富度、多样性和均匀度指数。ACE指数和Chao指数用于估计群落中OTU数目的指数；此处选取ACE指数和Chao指数来表示物种丰富度，ACE指数和Chao指数排列顺序为：T2>T1>CK，表明处理T2的土壤微生物物种丰富度更高；Simpson指数用于估算样本中微生物多样性，指数值越大，说明群落多样性越低；Simpson指数大小顺序为：CK>T1>T2，表明CK物种多样性最低，处理T2的物种丰富度更高；Heip指数用于衡量土壤细菌群落均匀度，指数值越大，说明群落结构更为均衡，Heip指数的排列顺序为：T2>T1>CK，表明处理T2的土壤细菌群落结构更均匀；Coverage是指各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，本试验中Coverage水平达到了近100 %。综上所述，处理T2具有提高大葱根际土壤细菌丰度、多样性和均匀度的作用。

2.2.2 门分类水平的优势细菌菌群分析 根据土壤细菌群落柱状堆叠图(图1)，可以直观呈现两方面信息，即：每一样本在某一分类学水平上含有何种细菌和样本中各种细菌的相对丰度。基于门分类水平发现：杂草不同防除模式下，大葱根际土壤细菌的优势菌门有10种，分别为：变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门(Planctomycetes)和Latescibacteria。其中，酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和拟杆菌门(Bacteroidetes)在处理T2的根际土壤中分别比对照增加了28.08 %、7.53 %和74.59 %。酸杆菌门细菌是一类基于新分类方法划分的细菌门，目前已有研究发现酸杆菌具有许多编码纤维素酶和半纤维素酶的基因[17]。此外，土壤中拟杆菌门细菌主要参与土壤有机质的分解[18]。绿弯菌门细菌属兼性厌氧微生物，是一类可通过光合作用产生能量的细菌。

表4 不同处理大葱根际土壤细菌测序序列统计及属水平多样性指数

2.2.3 属分类水平的优势细菌菌群分析 高通量测序结果基于属分类水平(图2)分析发现：不同杂草防除模式下大葱根际土壤细菌的优势菌属(>1 %)主要有假单胞菌属(Pseudomonas)、硝化螺旋菌属(Nitrospira)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、类诺卡氏属(Nocardioides)、玫瑰弯菌属(Roseiflexus)、酸微菌属(Acidibacter)、Gaiella、和Chryseolinea10个菌属。其中，处理T1和T2中假单胞菌属(Pseudomonas)变化幅度最大，比对照分别减少了486 %、925 %，假单胞菌属细菌具有降解蛋白质和淀粉的作用[19]；硝化螺旋菌属细菌广泛应用于城市污水处理厂进行生物脱氮[20]，链霉菌属细菌广泛分布于有机物丰富、酸度和含水量适中的土壤中对土壤中复杂有机物的矿化发挥重要作用。Chryseolinea具有降解单糖、二糖、多糖及部分有机酸的作用[21]。

图1 不同处理大葱根际土壤细菌门分类水平的相对分布Fig.1 Relative abundance distribution of species in different treatments at phylum level

图2 不同处理大葱根际土壤细菌属分类水平的相对分布Fig.2 Relative abundance distribution of species in different treatments at genus level

3 讨 论

土壤中的微生物生物量、酶活性以及微生物多样性均可作为指示土壤肥力和评价土壤健康状况的敏感生物学指标[22-24]。不同杂草防除模式影响着大葱根际土壤中可培养微生物数量，木糠覆盖处理大葱根际土壤中可培养细菌、真菌数量与对照组之间均达到显著性差异水平，这一结果与前人研究结果一致[25]，表明木糠覆盖改变了大葱根际微环境，改善了土壤结构，为微生物创造了良好的生存和繁殖环境。木糠覆盖处理大葱根际土壤中β-葡糖苷酶活性显著高于对照，人工除草和木糠覆盖处理大葱根际土壤中氨肽酶活性亦显著高于对照，表明人工除草和木糠覆盖处理促进了大葱根际土壤中碳和氮的转化，提高了碳和氮的循环速率，改善了大葱根际土壤的碳和氮肥力状况，这一结果与白雪等[26]和李旺霞等[27]的研究结果相似。此外，木糠覆盖具有常规地膜不具备的优势，木糠可逐渐被微生物分解，提高了土壤有机质的含量。人工除草和木糠覆盖处理大葱根际土壤中微生物生物量碳、氮显著高于对照，但微生物生物量磷与对照之间无显著差异，这一结果与魏静等[28]研究微生物生物量碳、氮和磷的结果相类似，表明人工除草和木糠覆盖有利于丰富大葱根际土壤中的碳和氮库的储备量，提高了大葱根际土壤肥力。与人工除草方式相比，木糠覆盖处理并未增加土壤中磷的含量，可能是木糠中磷含量不高导致微生物摄入或分解量不高等原因所致。

基于高通量测序结果可知，人工除草和木糠覆盖模式均有助于提高大葱根际土壤中细菌丰度、均匀度与多样性指数，而且木糠覆盖处理的提升效果更为显著。此外，与对照相比，人工除草和木糠覆盖处理虽然没有显著改变大葱根际土壤中优势细菌的组成，但显著改变了根际土壤中不同优势细菌的比例。其中，酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和、拟杆菌门(Bacteroidetes)是木糠覆盖处理中显著增加的优势菌门；假单胞菌属细菌则是人工除草和木糠覆盖处理中显著减少的优势菌属。大葱根际土壤中优势细菌组成比例的变化可能与人工除草或木糠覆盖改变了大葱根际土壤的水分含量、温度和光照等环境条件紧密相关。

4 结 论

木糠覆盖防除杂草的模式可以改善大葱根际土壤的健康状况，提高大葱产量，适宜作为南方大田作物生产中杂草生态防控的管理模式进行规模化推广。