RP-HPLC法测定可溶性CD95-Fc融合蛋白中异天冬氨酸的含量

于雷 陶磊 毕华 李响 饶春明

[摘要] 目的 测定可溶性CD95-Fc融合蛋白中异天冬氨酸（IsoAsp）含量。 方法 采用ISOQUANT？誖异天冬氨酸检测试剂盒结合反相高效液相色谱法测定样品中IsoAsp含量，采用Phenomenex Synergi 4 μm Hydro RP-80 C18色谱柱（150 mm × 3 mm，4 μm），以7.9 mmol/L磷酸二氢钾-1.1 mmol/L磷酸氢二钾-10%甲醇为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，流速为0.43 mL/min。 结果 对照品和3批原液中IsoAsp含量相近（0.30～0.32 mol/mol sCD95-Fc），3批成品中IsoAsp含量明显增高（0.51～0.53 mol/mol sCD95-Fc）;25℃和37℃处理24 h后成品中IsoAsp含量无明显变化，60℃处理后明显增加。 结论 该法适用于可溶性CD95-Fc融合蛋白中IsoAsp含量检测，高温处理可加快样品中IsoAsp生成。

[关键词] 可溶性CD95-Fc;异天冬氨酸;脱酰胺修饰;反相高效液相色谱

[中图分类号] R914          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（c）-0109-04

[Abstract] Objective To determine the content of isoaspartate （IsoAsp） in soluble CD95-Fc fusion protein. Methods IsoAsp content in samples was determined by ISOQUANT Isoaspartic Acid Detection Kit combined with reversed-phase high performance liquid chromatography. Phenomenex Synergi 4 μm Hydro RP-80 C18 column （150 mm × 3 mm， 4 μm） was used. Potassium dihydrogen phosphate-1.1 mmol/L potassium dihydrogen phosphate-10% methanol was used as mobile phase A， methanol as mobile phase B， gradient elution was performed at a flow rate of 0.43 mL/min. Results The content of IsoAsp in reference material was similar to that in three batches of raw liquor （0.30-0.32 mol/mol sCD95-Fc）. The content of IsoAsp in three batches of finished products increased significantly （0.51-0.53 mol/mol sCD95-Fc）. The content of IsoAsp in finished products did not change significantly after 24 hours of treatment at 25℃ and 37℃， but increased significantly after treatment at 60℃. Conclusion This method is suitable for the determination of IsoAsp in soluble CD95-Fc fusion protein. High temperature treatment can accelerate the formation of IsoAsp in samples.

[Key words] Soluble CD95-Fc; IsoAsp; Deamidization; Reversed-phase high performance liquid chromatography

重組蛋白类制品的化学稳定性对其安全性和有效性至关重要。在生产和储存过程中，某些热点氨基酸残基易受到不同类型的化学修饰，包括脱酰胺、异构化、氧化等[1]。其中，天冬酰胺（Asn）脱酰胺和天冬氨酸（Asp）异构化是比较常见的化学修饰，两者均会形成异天冬氨酸（IsoAsp），可能影响蛋白的体内生物学活性和体外稳定性。研究[2]表明，生产和储存过程可能会对蛋白中IsoAsp的含量造成影响。因此，IsoAsp的检测对重组蛋白类药物极为重要，其能够作为监测药物活性功能改变的重要指标，在药物质量控制、制剂配方优化、储存条件筛选等方面发挥重要作用[3-4]。目前已有大量研究[6-11]开发了针对重组蛋白的IsoAsp分析技术，尤其是单抗类制品，主要分析技术包括等电聚焦（IEF）、离子交换色谱（IEX）、疏水作用色谱（HIC）、亲水作用色谱（HILIC）[5]、胰蛋白酶肽图等。IsoAsp和Asp的分子量、电荷均相同，两者很难区分，往往需要先将大的蛋白质消化成小片段，经不同方式分离后使用质谱检测器进行鉴定[9，11-12]。这些方法通常耗时、低效，且在样品处理过程可能产生新的IsoAsp，从而造成结果不准确[10]。Promega公司推出了一款ISOQUANT？誖试剂盒，其基本原理是利用蛋白L-异天门冬氨酰甲基转移酶（PIMT）催化S-腺苷-L-蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）上的甲基转移到样品中的IsoAsp羧基上，同时SAM转换成S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine，SAH），SAH的摩尔含量与IsoAsp相同，SAH采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分离定量[4，10]。该方法快速、准确，不需要质谱检测器，更适用于常规检测。

可溶性CD95-Fc（soluble CD95-Fc，sCD95-Fc）融合蛋白是一种用于治疗多形性成胶质细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）和骨髓增生异常综合征（myel-odysplasticsyndrome，MDS）的创新生物技术药物[13-14]。它是由CD95胞外结构域和IgG1抗体Fc段组成的全人源融合蛋白，可以与肿瘤细胞表面的CD95L结合，从而抑制多个信号途径，阻断肿瘤细胞生长[15-17]。sCD95-Fc可显著延长复发性胶质母细胞瘤患者生存期[18-19]。建立和完善sCD95-Fc的质量控制体系是保障其安全性和有效性的重要手段。sCD95-Fc蛋白中的Asn位点均有不同程度的脱酰胺修饰，因此对样品中IsoAsp的含量进行监测是非常必要的。本研究采用ISOQUANT？誖试剂盒结合RP-HPLC法测定sCD95-Fc对照品、原液和成品中IsoAsp含量，并考察不同温度热处理后成品中IsoAsp含量变化。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超高效液相色谱系统配PDA检测器（Waters公司）、H2O3金属浴（金银杏生物科技公司）、Phenomenex Synergi 4 μm Hydro RP-80 C18色谱柱（150 mm×3 mm，4 μm）（Phenomenex公司）。

1.2 试药

ISOQUANT？誖异天冬氨酸检测试剂盒（MA1010）购自Promega公司;磷酸二氢钾和磷酸氢二钾均为国产分析纯试剂;HPLC级甲醇购自Fisher Scientific公司。sCD9-Fc融合蛋白对照品、3批原液和3批成品为中国食品药品检定研究院留存样品。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 sCD9-Fc样品前处理  取出ISOQUANT？誖异天冬氨酸检测试剂盒、sCD95-Fc对照品和样品，解冻后于室温平衡30 min。分别用Q水稀释sCD9-Fc对照品和样品至2.0 mg/mL。取对照品、样品和Q水（空白对照）各80 μL，加入主反应混合物（Q水∶5×反应缓冲液∶SAM∶PIMT=16∶40∶4∶40，现用现配）80 μL，混匀后于27℃的加热块中放置45 min。加反应终止液32 μL，混匀后12 000 r/min离心1 min，离心半径3 cm，取上清上机测定。

2.1.2 异天冬氨酸-人促睡眠肽样品制备  异天冬氨酸-人促睡眠肽（IsoAsp-DSIP）是具有9个氨基酸的活性肽，其氨基酸序列为Trp-Ala-Gly-Gly-IsoAsp-Ala-Ser-Gly-Glu[20]。其IsoAsp摩尔浓度与蛋白摩尔浓度相同。取8 μL IsoAsp-DSIP母液（101.97 μmol/L）加入93.97 μL水，即为8.0 μmol/L。取80 μL参照“1.2.1”处理。

2.1.3 SAH对照品溶液制备  分别采用Q水稀释SAH对照品母液（15.00 μmol/L），制备5个不同浓度点SAH对照品溶液，使50 μL进样量中分别含有360、270、180、90、45 pmol SAH。

2.1.4 色谱条件  流动相A：7.9 mmol/L磷酸二氫钾-1.1 mmol/L磷酸氢二钾-10%甲醇;流动相B：甲醇。进样器温度：（5±3）℃;柱温：（25±3）℃;泵流速：0.43 mL/min;最大柱背压：5000 psi;PDA检测器：210～400 nm，3D，1.2分辨率;进样量：50 μL;梯度洗脱。洗脱梯度见表1。

2.2 结果

2.2.1 SAH最大紫外吸收波长测定  根据SAH对照品的3D色谱图，5.203 min处该组分最大紫外吸收波长为259.3 nm，同时260 nm色谱图的最大吸收峰也处于5.206 min。因此，本研究中所有的数据分析均基于260 nm色谱图结果。

2.2.2 系统适用性  序列前、中、后各进2针270 pmol SAH对照品，以在试验的不同阶段考察系统的适用性。6次进样的SAH峰面积RSD仅为0.36%，理论塔板数均>6000，拖尾因子均<1.5。

2.2.3 SAH标准曲线  分别取360、270、180、90、45 pmol SAH对照品溶液，注入色谱仪，按照“2.1.4”项下检测，记录色谱峰。以3次进样的峰面积均值对SAH含量进行线性回归，得到SAH标准曲线y = 1391.2x- 4272.8，R2 = 0.9998。360、270、180、90、45 pmol SAH对照品溶液及IsoAsp-DSIP样品的色谱图。

2.2.4 IsoAsp-DSIP回收率  理论IsoAsp含量为8 μmol/L（pmol/μL），进样体积为50 μL，进样量为8×80/192×50=166.7 pmol。将3次进样的峰面积均值代入标准曲线，计算实测SAH含量均值为169.5 pmol，回收率为101.7%。IsoAsp-DSIP样品的色谱图。

2.2.5 sCD95-Fc样品中IsoAsp含量  将sCD95-Fc对照品、原液和成品的峰面积均值代入标准曲线，计算进样SAH含量。sCD95-Fc蛋白的理论分子量为87 kD，2.0 mg/mL的摩尔浓度为23.0 μmol/L（pmol/μL）。进样sCD95-Fc蛋白含量为23.0×80/192×50=479.2 pmol。3批原液与参考品相近，而3批成品的IsoAsp含量明显增加。结果见表2。

2.2.6 热处理后sCD95-Fc成品中IsoAsp含量变化  本研究采用热加速实验，进一步考察储存过程对sCD95-Fc成品中IsoAsp含量的影响。将同一支样品分装至4个离心管中，分别于4℃、25℃、37℃和60℃放置24 h，同法测定IsoAsp含量。25℃、37℃下放置的样品与4℃下放置的样品比较，其IsoAsp含量无明显变化，而60℃处理后，其IsoAsp含量明显增加。不同温度处理后IsoAsp含量见表3，sCD95-Fc成品P01的色谱图。

3 讨论

本研究采用ISOQUANT？誖试剂盒结合RP-HPLC法测定sCD95-Fc对照品、原液和成品中的IsoAsp含量。对照品和原液的IsoAsp含量为0.30～0.32 mol/mol sCD95-Fc。sCD95-Fc对照品和原液中，除了N-糖基化位点的Asn之外，其他几个位点的Asn均有不同程度的脱酰胺修饰，其中第6位修饰率为14%左右，第312位为12%左右，两者理论上贡献IsoAsp含量为0.28 mol/mol sCD95-Fc，再加上另外几个Asn位点的潜在修饰（2%左右）以及Asp异构化形成的IsoAsp（极少量），IsoAsp总含量为30%左右。

3批成品间和3批原液间IsoAsp含量均相似，提示该产品不同批次的生产工艺较稳定。原液和对照品的IsoAsp含量相近，而成品中IsoAsp含量比原液增加了70%。分析原因可能有以下几点：①制剂缓冲液成分、稳定剂能可能引起Asn脱酰胺或Asp异构化;②制剂pH与原液不同;③储存温度，原液和对照品储存于-70℃，而成品储存于4℃，温度升高可能会引起IsoAsp生成速率加快。为进一步考察储存温度对IsoAsp含量的影响，将sCD95-Fc成品分别于4℃、25℃、37℃和60℃放置24 h后测定其IsoAsp含量。结果显示，尽管25℃和37℃下放置的样品与4℃下放置的样品比较，其IsoAsp含量无明显变化，但是60℃处理后，其IsoAsp含量明显增加，提示高温加速了IsoAsp的生成。综上所述，储存条件对IsoAsp生产速率影响显著，IsoAsp含量的检测对指导制剂配方优化和储存条件的筛选具有重要意义。此外，IsoAsp含量的监测也可成为考察生产工艺及储存过程稳定性的重要方式。

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（收稿日期：2018-03-23  本文編辑：王   蕾）