微生物学无菌操作技术实验的教学改进

叶泉清

(广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541006)

建立“无菌概念”和掌握“无菌操作技术”是学习微生物学的学生必须经受的最基本的训练。所谓“无菌操作”是指通过一定的技术来保证目的微生物在转移过程中不被环境中的微生物污染，这些技术包括用接种环(针)、吸管、涂棒等工具进行接种、稀释、涂片、计数和划线分离等[1]。由于无菌操作的规范性直接影响到后续实验，高校教师在近些年进行的微生物学实验教学改革中愈加重视无菌操作技术，例如，张杰等[2]确立了基础的微生物学实验以无菌操作技术为核心展开课程的合理设置；黄碧芳等[3]通过挖掘无菌操作技术的基础性和内在知识的联系性设计关联实验。广西师范大学的微生物学实验面向生物科学、生物技术、环境生态工程专业开设，使用的教材是沈萍、陈向东主编的《微生物学实验》(第4版)，该书的“实验2无菌操作技术”主要内容是用接种环转接菌种；教学时，通常老师先演示操作过程并讲解，之后学生独自逐步模仿，并参考教材上的操作步骤以及图示调整动作，老师进行巡视和纠错。实践结果表明，在这种教学模式下，学生容易出现接种环灼烧灭菌不彻底，不能保持在酒精灯火焰旁边完成整个操作等问题，无菌操作不够规范，教学效果与预期目标有差距，与该实验的重要性不相称。这主要是由于教材内容的某些不足导致学生对操作的要求认识不到位，而老师在做操作讲解时缺少相应提示或强调不够，以致学生出现操作错误却意识不到的情况；此外，菌种斜面使用棉塞与教材中使用试管帽不一致使得学生在操作时产生困惑，影响到操作的正确性。因此，探讨问题的成因，并对教学内容做适当的改进，使学生在初次学习无菌操作时对操作要求有清晰而充分的认识，并掌握规范的转接菌种的操作，为后续对其他无菌操作的学习奠定良好基础是十分必要的。关于无菌操作技术的研究，文献报道集中在植物组培[4-5]、食品微生物检验[6-7]、医疗护理[8-9]、无菌制剂生产[10-11]、食用菌生产[12]等领域，在微生物实验教学上的研究报道较少。本文就该实验教学中学生用接种环转接菌种的无菌操作出现的主要问题展开探讨，并提出改进建议；另外，结合实践经验归纳出使用棉塞的菌种斜面的转接操作步骤，作为教材内容的补充，以满足实际教学的需要，并可作为开展斜面接种工作的参考。

1 教学过程中出现的问题及探讨

1.1 拿捏接种环、试管等的手部姿势不正确

在教学中发现不少学生受平时习惯的影响，多使用右手以掌背朝上的姿势拿捏接种环，于是便看到相应的操作：拔试管塞(帽)时，右手掌为了让手掌边缘靠近并夹住试管塞(帽)拔出，必须翻转掌心朝上，这导致拇指与食指拿捏的接种环也翻转180°，环端从火焰旁边掉转离开，使已灭菌的接种环可能染上杂菌；有的学生甚至没有翻掌即顺手拔塞，结果使试管塞的塞入部分被夹在掌缘内侧，可能被手掌的杂菌污染。而当使用左手以掌背朝上的姿势拿捏菌种斜面试管，刮取菌苔时手的背面会遮挡试管下部，学生为了看清刮菌位置及接种环是否刮上菌，只好俯身侧头观看，缩短了身体与管口操作区的距离，如图1所示；或者无意间把试管口从火焰旁边移开拉近到眼前位置操作，两种方式都增加了污染风险。可见，正确拿捏接种环、试管的手部姿势对后续操作有较大的影响，有必要予以规范从而避免学生的随意性。而教材在操作步骤和图题说明中没有准确的手部姿势描述和应用要求，学生在看图时未必关注手部姿势并准确模仿，当老师重视不够的情况下，学生的拿捏动作难免表现随意。

图1 以掌背朝上的手势拿捏接种环、菌种斜面的取菌操作

1.2 不能保持在酒精灯火焰旁边完成整个操作

在实验过程，有的学生站着操作，管口远离酒精灯火焰；有的学生在火焰旁边拔塞、刮取菌苔，而塞棉塞、接入菌种时则偏离火焰较远，没有始终保持在火焰旁边完成操作。其原因包括：或是怕烫到手，或是不清楚距离酒精灯火焰多远才合适，也有因手部姿势不正确导致。而教材在基本原理中阐述了高温对微生物具有致死效应，因此在微生物的转接过程中，一般在火焰旁进行，操作步骤中也多处写明在火焰旁如何做，但都没有给出一个明确的距离，因而学生不好把握，仅能凭个人臆测去做。学生认识上的模糊反映出教材在基本原理中阐述不够清晰，内容有欠缺，而老师不注意对无菌操作范围作进一步的说明，学生无法理解透彻，没有形成“无菌操作范围”的观念，内心无准绳就难免出错。

1.3 接种环的灼烧长度较短，灭菌不彻底

转接菌种前要求对接种环进行火焰灼烧灭菌，在教学中看到不少学生灼烧了环端及镍铬丝段就止住，没有延伸灼烧金属杆前段，而该部位在接种时往往会伸入到试管中，也需要灭菌。此前，老师做了示教演示，可能因动作连贯，边做边说，有的学生未必注意到接种环灼烧到金属杆前段这一细节；另外，老师还可能疏忽了对灼烧长度的要求。而教材的图示缺少详细操作说明，学生在看图未能弄清图意时没有获得必要的提示，以致独立操作中灼烧灭菌不到位却未意识到错误。

1.4 管口的灼烧灭菌不够均匀、充分，容易引燃棉塞

教材的操作步骤(2)“在火焰旁打开斜面培养物的试管帽，并将管口在火焰上烧一下”[1]，我们没有试管帽，用的是棉花塞，器材的不同令学生产生操作困惑，若照搬步骤(2)应在火焰旁打开棉塞并将管口烧一下，对此，学生有疑问“打开棉塞时管口处粘附的杂菌是否因震动掉落管内引起污染？”。经讨论，认为试管帽在外面包裹管口因而管口位置较为洁净，打开后再将管口烧一下灭菌是可以的，而棉塞或硅胶塞从管口塞入，接缝处积存杂菌，且棉塞露空部分也粘附杂菌，因而拔塞前管口应该先过火灭菌。不过，该操作缺乏规范，学生通常是顺手将管口伸到火焰上方灼烧灭菌，这使得棉塞尾部的纱布很容易被点燃，如图2所示。于是，改将管口伸到离火焰较高的位置快速过火，由于怕烧到棉塞，操作显得匆忙而慌乱，管口部位没有得到均匀、充分灼烧，灭菌不彻底。怎样操作是安全而有效？这是对带棉塞的管口或瓶口灼烧灭菌时通常遇到的问题，并令人困扰，而学生操作中的随意发挥还存在安全隐患，因此，应该探究如何规范操作以降低风险。

教学中出现的问题与教学方法、教学内容密切相关，上述探讨不难看出某些问题与教材内容的不足之处也相关，体现在学生对酒精灯火焰旁边的操作范围不明确、教材图示说明有欠缺、步骤中对易造成污染的操作细节提示不够。因此，需要对教学内容做适当的改进；对实际教学中因使用器材的不同导致操作的改变则需要归纳形成新的操作步骤。

图2 在火焰上方灼烧管口灭菌，容易引燃棉塞

2 对教学内容的改进

2.1 规范拿捏接种环、试管等的手部姿势

教材中描述拿捏接种环、试管等的手部姿势的内容为：右手是掌心朝上，拇指在上方与下方的食指、中指相对拿捏接种环的金属杆后端，左手也是掌心朝上，拇指在上方与食指、中指相对拿捏菌种斜面试管的下部，如图3所示；并说明以这样的手势拔试管塞(帽)并灼烧管口、刮取菌苔，操作顺手且有利于刮菌时的观察。老师要做好示范动作，并在开始操作时即明确提出应用要求让学生做出模仿，然后通过老师的巡视纠错，使部分学生留意到自己的习惯性手势不利于开展操作。

图3 以掌心朝上的手势拿捏接种环、菌种斜面的取菌操作

2.2 明确在酒精灯火焰旁边无菌操作的范围

在基本原理中，增加酒精灯火焰周围无菌区的知识点，明确操作范围，使学生可以较详细地了解无菌操作在火焰旁进行的道理，弄清楚操作时与火焰的距离。酒精灯火焰的高温辐射对微生物有致死效应，燃烧导致的气流上升使携带微生物的尘埃难以停留、降落，因此在酒精灯火焰的周围产生一个接近无菌的空间，通常认为，其灯芯上方的火焰旁边5 cm范围内为无菌区，如图4所示。所以，操作应在此范围内进行为最好，例如，打开的试管口和瓶口保持对着火焰，可以防止外界的微生物落入。据实践经验可知，常规的无菌操作保持在火焰旁边3～5 cm范围内进行是可行的，例如，菌种斜面转接时试管(18 cm×18 cm)管口可保持在火焰旁边3 cm范围内操作，倒平板时三角瓶瓶口(广口250 ml)可放在火焰旁边5 cm范围内操作。通过明确操作位置与火焰的距离，学生在操作过程中可以度量管口或接种环的停放位置是否越出范围，从而及时改正。不过，对于初学者来说，由于动作生疏，难免顾此失彼，操作中有时偏离了酒精灯火焰旁边，因此，树立“无菌操作范围”的观念有一个过程，需要老师多予提醒，通过强化观念，练习动作，逐渐养成知行合一的规范操作。

图4 酒精灯火焰旁边接近无菌的空间示意图

2.3 接种环等金属工具的灭菌应灼烧至必要长度

在教学内容中增加接种环灼烧灭菌的操作说明：1)竖提接种环将环端倒置于火焰中灼烧至发红；2)斜置接种环来回灼烧镍铬丝段；3)延伸来回灼烧金属杆前段，并转动使各处均匀过火，如图5所示；4)灭菌后的接种环镍铬丝段停放于火焰旁边的无菌区。另外，在教学中还要说明这样做的原因，是因为伸入试管中的部分(包括金属杆前段)必需灼烧彻底灭菌，以防范在刮取菌种和接入菌种过程中杆上的杂菌飘落管内造成污染。学生弄清原因之后，就会判断自己应该灼烧接种环到什么位置，进而懂得以后在使用解剖刀等金属工具时也需要灼烧至必要长度来防范污染。

图5 接种环的灭菌应灼烧至金属杆前段

2.4 管口灭菌使用比较安全、有效的做法

带棉塞的管口应该怎样灼烧灭菌？笔者开展了探索，结合实践经验摸索出了比较可靠的手法。观察可以看出，将管口伸到酒精灯火焰上方时，外焰火苗长且飘动容易引燃棉塞，而中部的火焰较为稳定适宜管口停留。以左手掌心朝上拿起一支试管，移管口靠近中部火焰左侧旁边，一边以拇指向右捻转试管，一边通过手臂拉伸使管口来回过火2周，从而使管口得到均匀、充分地灼烧，如图6所示。由于能稳妥控制棉塞与火焰的距离，且在转动中灼烧，因而棉塞不容易被引燃。学生运用这样的手法灼烧管口，充分灭菌后再拔棉塞，即可顺利完成操作。类似做法也适用于使用大棉塞的三角瓶，在倒平板时右手握瓶底左手托举瓶身，斜伸瓶口到酒精灯火焰中部左侧，转动瓶口灼烧2圈之后移位灼烧上下部分，然后再拔棉塞，这样的操作稳当安全。对于使用硅胶塞的试管、三角瓶也可以采用这种做法，进行管口、瓶口灭菌。这一做法可规范学生的操作，弥补此前该操作难以形成规范要求的不足，使操作全程有较为明确、可行的规范要求，便于教与学。

初学无菌操作时，学生着重于对动作的模仿，对于为什么这样做认识不足，理解有限，遇到使用棉塞等与教材不同的实验器材或变化的实验条件时难免无所适从。因此，在示教时老师需要有“庖丁解牛”的意识将连贯操作分解为单项动作，演示不能过快，同时讲清楚做动作的目的以及做到的程度，使学生看清楚动作，听明白要求，并通过反复练习、体会，理解无菌操作的基本原则和要求，熟练操作；这样，今后学生在面对变化的实验器材时就懂得设计操作动作，灵活地运用各种无菌操作技术进行应对。

图6 在火焰中部旁边灼烧管口灭菌的操作示意图

3 操作步骤的重新归纳

由于采用与教材不同的管口灼烧灭菌做法，使前后的操作产生了相应的变化，教材上的操作步骤有不适合地方，因此，针对广西师范大学在微生物实验教学中菌种斜面通常使用棉塞的情况，本文归纳形成新的斜面接种操作步骤供教学参考，并作为教材内容的补充；在步骤中对易造成污染的细节增加了注意提示。具体有如下4个步骤。

1)右手拇指与食指、中指相对拿捏接种环的金属杆后端，提起接种环进行火焰灼烧灭菌，使环端倒置于火焰中灼烧至发红，再斜置接种环来回灼烧镍铬丝段，然后延伸来回灼烧金属杆前段，并转动使各处均匀过火，如图5所示。灭菌后的接种环停放于火焰旁边。注意：接种环伸入试管中的部分(包括金属杆前段)必须灼烧彻底灭菌。

2)左手掌心朝上拇指与其余四指相对拿捏待接种斜面试管后端，管口朝前略为上倾移近酒精灯火焰中部左侧，一边以拇指向右捻转试管一边通过手臂拉伸使管口来回过火，灼烧塞入部位至棉塞露空部分，转动2周均匀灼烧，如图6所示。移动该管入虎口以拇指根部压住，然后拿起菌种斜面试管以同样手法灼烧管口灭菌。

3)左手指推移菌种斜面试管后端使试管转为横向，管口位于火焰正前方，斜面朝上，食指钩住待接种试管；右手掌心朝上拿捏接种环，将环圈至金属杆前段快速过火一个来回，然后以手掌边缘夹住棉塞拔出，将接种环小心伸入菌种斜面试管的上半部(此时不要接触斜面培养物)，至少冷却10 s后，轻压环圈平贴菌苔刮起少许培养物(可停顿观察，环圈附有粘稠物显得湿润应是刮有菌)，如图3所示；退出接种环，将管口、棉塞分别在火焰上快速绕圈烧一下然后塞入，就近放菌种试管在酒精灯旁边的矮小搁架上(可用细铁丝自制“工”形小搁架)。注意：以掌心朝上的手势操作，拔棉塞、刮菌、塞棉塞应保持管口在火焰旁边3～5 cm范围内进行，棉塞不能放在桌上；接种环伸入试管前最好快速过火一下，以烧死停放期间可能飘落的杂菌。

4)左手指推移待接种斜面试管转为横向，管口位于火焰正前方，右手迅速夹住棉塞并拔出，将接种环小心放进试管斜面的底部并从下向上划一直线，然后再从底部开始向上作蛇形划线接种。完毕后，将管口、棉塞分别烧一下然后塞入放回试管架；斜置接种环灼烧环端杀灭余菌，并延伸灼烧其他部位，彻底灭菌后将接种环斜放火焰旁边待接下一管。注意：接种环不要碰到试管口边；拔棉塞、划线接种、塞棉塞要保持管口在火焰旁边3～5 cm范围内操作。

斜面接种通常需要从一支菌种转接多支斜面，可以在步骤4)之后这样操作：左手拿起一支待接种斜面以相同手法灼烧管口灭菌，再以食指钩住该管，用其余四指捏住菌种斜面试管后端拿起并伸管口到火焰上方快速过火，然后翻腕使管口另一面也过火，横置菌种试管使管口位于火焰正前方，之后衔接步骤3)、步骤4)完成转接，通过操作循环即可快速转接出多支斜面。

4 结束语

实践表明，上述教学内容的改进可以增进学生对无菌操作要求的理解，减少错误，动作更加到位、规范，实验教学效果获得提升。由于目的或材料不同，微生物实验中无菌操作的具体步骤有所差异，但原则和基本动作是一致的，因此，该实验奠定的良好基础能起到触类旁通的作用，此后学生学习倒平板、微生物制片、微生物分离及纯化等其它无菌操作步骤就更加容易理解、掌握。本文整理的使用棉塞的菌种斜面的转接操作步骤适合教学实际，步骤中对平常将管口伸到酒精灯火焰上方灼烧灭菌的做法加以改进，改在中部火焰左侧一边捻转试管一边拉伸管口来回过火，使管口充分均匀灼烧，而棉塞不易被引燃，既保证了管口灭菌的效果，又保障了操作安全。由于每次是单管操作，可使菌种斜面、待接种斜面的管口都得到充分灼烧灭菌，因而可以减少污染，提高转种成功率。该操作在实验课前菌种准备、菌种转管扩繁和菌种保藏等需要转接较多斜面的工作中具有实用意义。

前些年，广西师范大学使用的教材是沈萍、范秀容、李广武主编的《微生物学实验》(第3版)，书中介绍斜面接种是以左手同时拿着菌种斜面试管和待接斜面试管开展操作[13]，在教学中发现学生一只手掌控两支试管进行操作不够便利：在管口灼烧灭菌时，两支管口靠近且担心棉塞被引燃，因而管口侧面未能做到充分灼烧灭菌；在火焰旁边对一支管口刮菌或接入菌时另一支管口往往偏离火焰旁边；右手夹持的两个棉塞在回塞一个时另一个棉塞因也靠近火焰稍不留意即被点燃。而本文整理的操作步骤克服了以上不足，对菌种斜面、待接种斜面试管分别单独开展管口灼烧灭菌、取菌或接入菌，塞棉塞等操作，因单支试管更易于掌控，从而使操作顺畅、动作到位，降低了污染风险。该操作步骤对斜面接种的无菌操作技术提出了一种有益的改进方法。