快速制备细胞周期样品方法评估和优化

吕红霞，杜立颖

(北京大学 生命科学学院，北京 海淀区 100871)

流式细胞术检测DNA含量和细胞周期广泛应用于基础及临床研究[1-3]。由于核酸荧光染料与核酸结合的量与DNA的含量成正比例关系，通过流式细胞仪检测，就可以得到细胞DNA含量及周期各时相细胞的百分含量。常用于细胞双链DNA含量检测的染料有碘化丙啶(propidium iodide,PI)，7-AAD，DAPI及Hoechst等[1,2,4-5]。PI可以被488 nm激光激发，并具有价格低廉、CV小等特点，是流式检测细胞DNA含量最为常用的染料。但PI染料不能穿透细胞膜，必须破膜后再进行染色。PI染色制备流式检测细胞周期样品方法有乙醇固定法和一步快速染色法两种[6-7]。前者细胞用70%乙醇固定透膜后进行PI染色，这种方法最为常用。但是乙醇固定法制备细胞样品需要时间较长，在实际操作中，经常出现由于细胞固定不当造成细胞破碎严重或固定后洗涤过程丢失细胞过多导致样品制备失败，无法获得需要的数据。快速染色法不需要乙醇固定和多次细胞洗涤，细胞直接在快速PI染液中一步完成细胞染色，大大减少了样品制备时间，降低了细胞损失，是一种快速便捷的样品制备方法[8-9]。大量文献对乙醇固定PI染色方法中PI浓度、染色时间等实验条件进行了充分的研究，但是目前尚未有文献对快速PI染色法进行系统评估。本文将对快速PI染色制备细胞周期样品方法进行系统的评估并进行进一步优化，为快速制备流式细胞周期样品提供参考依据。

1 材料

1.1 细胞株

人宫颈癌细胞系HeLa来自中国医学科学研细胞中心。

1.2 主要仪器

离心机(德国Eppendorf公司)，CO2培养箱(日本SANYO公司)，流式细胞仪(美国BD公司FACSVerse)。

1.3 主要试剂

PI、RNase A、柠檬酸钠，IGEPAL CA 630为美国Sigma公司生产；胎牛血清(fetus baffle serum,FBS)、DMEM培养基和PBS为美国HyClone公司生产。

2 实验方法

2.1 试剂配制

PI快速染液配制(100 ml)：PI 5 mg、IGEPAL CA630 30 ul、枸橼酸纳100 mg，加ddH2O至100 ml，调pH值7.2～7.6,用棕色瓶子分装，4°C避光保存，使用前加入RNaseA至终浓度50 μg/ml。

70 ml无水乙醇加30 ml ddH2O配制成70%乙醇，-20℃储存备用。用ddH2O配制1 mg/ml的PI储液避光保存备用。乙醇固定法细胞染色时用PBS稀释到50 μg/ml，添加RNaseA至终浓度50 μg/ml，4°C避光保存。

2.2 样品制备

将培养至对数生长的细胞用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞呈单细胞悬液，用含10%FBS DMEM培养基终止消化后，200 g离心3 min收集细胞。

将离心收集的细胞用预冷的PBS重悬，200 g离心3 min，弃上清；用快速PI染液按照1×106/ml密度重悬细胞，剧烈震荡，37℃避光染色30 min。

将离心收集的细胞用预冷的PBS悬起，200 g离心3 min，弃上清；加入-20℃预冷的70%乙醇1 ml重悬细胞，于4℃定30 min或-20℃固定过夜。固定好的细胞200 g离心5 min，弃去上清；用预冷的PBS悬浮细胞洗2遍，200 g离心3 min，弃上清；用配制好的PI染液按照1×106/ml悬浮细胞，室温避光染色30 min。

2.3 上机检测

打开BD FACSVerse流式分析仪，在BD FACSSuit软件中用CST Beads检测仪器的变异系数(coefficient of variance,CV),确定CV<2%。应用BD FACSSuit软件，在前向角散射光(FSC)/侧向角散射光(SSC)散点图中显示细胞群，在PE-A/PE-W散点图中去除粘连细胞，获取10 000个非粘连细胞，在PE-A通道直方图中显示单细胞群的荧光强度。

2.4 结果分析

采集的细胞周期数据用ModFit 3.0软件进行拟合分析，计算G1/G0、S期、G2/M期细胞比例、G1期CV值。粘连细胞比例采用FlowJo X软件分析。

2.5 统计学分析

数据分析采用GraphPad Prism5分析软件，进行单因素ANOVA分析，P<0.05为差异,有统计学意义。

(a)一步快速制样细胞周期分析 (b)乙醇固定法制样细胞周期分析

3 结果

3.1 快速制备细胞周期样品检测结果分析

为了评估快速PI染色法实验结果的可靠性，收集培养至对数期HeLa细胞，胰酶消化后分成两份，分别经低渗PI染色和乙醇固定PI染色制备样本，染色30 min立即上机检测，用ModFit软件拟合得到细胞周期图，如图1所示，并分析细胞群体在细胞周期中各时相的含量，如图2所示。结果显示，快速PI染色和乙醇固定PI染色样品G0/G1期含量分别为(64.42±1.37)%和(64.11±0.53)%，S期含量分别为(23.87±0.90)%和(23.25±0.50)%，G2/M期分别为(11.71±0.11)%和(12.64±0.22)%，G0/G1期的CV值分别为(4.61±0.02)%和(4.62±0.31)%。两种方法制备细胞样品在细胞周期各期含量及CV值统计学分析均无显著差异(p>0.05)，G0/G1期CV值小于5%，证明快速PI染色法获得的实验结果与乙醇固定方法相比没有显著差异。

3.2 快速PI染色样品保存时间对细胞周期分析的影响

为了评估快速PI染色样品保存时间对细胞周期分析的影响，收集生长至对数期的HeLa细胞经快速PI染色法染色30 min，立即上机检测或4℃保存2 d、4 d、6 d上机检测。采集的流式数据用ModFit软件拟合分析，得到细胞周期中各时相DNA含量，如表1所示。经统计学分析，各时项细胞含量无显著差异(P>0.05)，但是不同染色时间CV比值和DNA荧光强度有显著差异(P<0.01)。由于CV值增大会影响到S期细胞比例的分析，快速PI染色制备的样本应尽快上机检测，不适宜过长时间放置。

3.3 快速PI染液中添加血清对细胞粘连的影响

在试验过程中，我们发现有的细胞系黏度很大，上样速度非常缓慢。有文献报道，血清可以降低细胞粘连并提高上样速度[10]。收集生长至对数期的293T细胞，在快速PI染液中分别加入0%，1%，2%，4%的FBS，染色30 min后立即上机检测，分析血清对周期样品制备的影响。如图3所示，结果显示，不添加血清细胞粘连比例为(12.10±0.25)%，添加1%血清细胞粘连比例为(7.99±0.28)%，添加2%血清样品，细胞粘连比例为(5.41±0.50)%，添加4%血清样品，细胞粘连比例为(3.32±0.09)%。从以上结果可以看出，与不添加血清相比，添加血清能降低粘连细胞的百分比。同时，添加血清的样本上机测试能有效防止进样针堵塞，显著提高上样速度。分析添加不同浓度血清染色的样本细胞周期各时相比例，结果发现添加血清与不加血清相比，样本的细胞周期分布没有显著差异，如图4所示。以上结果显示，添加血清能有效减少细胞粘连，进一步优化快速PI 染色制备细胞周期的样本的实验方法。

表1 不同染色时间细胞周期各时相含量，CV及G1期DNA荧光强度比较

表1 不同染色时间细胞周期各时相含量，CV及G1期DNA荧光强度比较

染色时间G0/G1期细胞/%S期细胞/%G2/M期细胞/%CV/%G1期DNA荧光强度30 min58.08±0.4313.18±0.4128.74±0.513.60±0.0656.85±0.142 d58.66±0.6213.35±0.8327.98±0.495.26±0.1757.10±0.404 d59.09±0.6513.01±1.1227.90±1.764.30±0.0261.29±0.176 d59.16±0.9513.02±0.9428.42±0.855.44±0.5559.19±0.85

图2 一步快速和乙醇固定法PI染色样品细胞周期各时相含量和CV值比较

图3 不同浓度血清对样品细胞粘连的影响

图4 比较不同浓度血清处理样本的细胞周期比例变化

(a)人胚胎干细胞H1细胞系 (b)293T细胞

(c)3T3细胞 (d)原代分离猪主动脉上皮细胞

图5 一步快速PI染色不同细胞系细胞周期分析图谱

3.4 快速PI染色制样法在其他细胞系的应用

为了验证这种快速样品制备方法的可靠性，我们收集了293T细胞、原代分离猪主动脉上皮细胞、人胚胎干细胞H1细胞系、3T3等多种不同来源的细胞样本，采用快速PI染色制备样品进行细胞周期分析。结果发现，G0/G1期CV值均比较低，如图5所示，获得了可靠的实验结果。

4 讨论

DNA含量测定和细胞周期分析是流式细胞术在基础科学研究和临床诊断中应用最早也是最成功的方法，目前仍然是最重要的应用之一。流式细胞术可以检测到细胞中DNA的含量，从而判断细胞群体所处细胞周期时相的比例和变化。常用的染料有多种，不同DNA染料需要用不同波长的激光激发。PI染料使用蓝色激光488 nm激发，是流式细胞周期分析中应用最广泛的DNA染料[10-11]。制备细胞周期样品最常用的方法是通过70%乙醇固定透膜后进行PI染色，大量文献对这一方法就乙醇固定时间、PI使用浓度、PI染色时间、样品保存时间等进行了详尽的研究[12-13]。但是目前尚未有文献对快速PI染色法进行系统评估。本研究比较了快速一步法和乙醇固定法PI染色法制备细胞周期样品方法，细胞流式检测ModFit 拟合分析结果显示，两种方法制备的细胞样品在细胞周期各时相细胞比例和G0/G1期CV值基本一致，统计学上无显著差异，这一结果提示快速PI染色法是一种可靠的细胞周期样品制备方法。

本文还对快速PI染色制备的细胞样品放置时间进行了研究，实验结果显示，放置6天内的样品各时相比例没有显著差异，但是CV值变化较大，G0/G1期DNA荧光强度也有较大差异。建议样品制备后尽快上机检测，从而获得可靠的分析数据。

在试验过程中，我们发现有的细胞类型快速一步法PI染色后粘度很高，300目滤网过滤后上机检测时细胞流速非常低，采集一个样本需要很长时间，大大延长了样本采集时间，也会影响结果的准确度。本文在一步快速染液中添加不同浓度的血清，流式分析粘连细胞的比例，结果发现添加适量血清能够明显降低样品中粘度，大大提高进样速度，进一步优化了快速PI染色制备细胞样品的方法。

5 结束语

针对流式检测细胞周期样品快速一步法PI染色方法，与乙醇固定制样方法比较，证明其可靠性，并研究了该方法染色放置时间对结果的影响，并通过添加2%～4%血清降低细胞粘度进一步优化了该实验方法。