天津地区草莓根腐病病原菌分离鉴定及室内毒力测定

姚玉荣 霍建飞 郝永娟 刘春艳 王万立

摘要：草莓根腐病是草莓生产中的主要病害之一，且随着草莓种植年限的增加而加重。明确草莓主要栽培地区根腐病致病菌种类，能够正确指导草莓根腐病的防治。本研究采用组织分离法从天津市主要草莓种植基地草莓根腐病病株分离纯化7个菌株。通过形态学和分子生物学鉴定，结果显示引起草莓根腐病病原菌有两种：胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。抗药性测定结果显示戊唑醇对胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌抑菌活性最好;苯醚甲环唑、咪鲜胺、吡唑醚菌酯、福美双次之;氟唑菌酰胺、甲基硫菌灵对不同地区菌株的抑菌活性差异较大。

关键词：草莓;根腐病;分离;鉴定;毒力测定

中图分类号：S436.68+4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）02-0107-04

Isolation and Identification of Strawberry Root Rot

Pathogen in Tianjin and Virulence Determination Indoor

Yao Yurong， Huo Jianfei， Hao Yongjuan， Liu Chunyan， Wang Wanli

（Tianjin Plant Protection Institute， Tianjin 30038 China）

AbstractStrawberry root rot is one of the main diseases occurring in strawberry production， which is aggravated with the increase of cultivation years. Exploring the pathogen species of strawberry root rot is useful for its effective control. By tissue isolation method， 7 fungal strains were separated and purified from strawberry root rot samples collected from main planting areas of strawberry in Tianjin. Through morphological and molecular biological identification， two strains were identified as Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum wich caused strawberry root rot disease. The results of virulence determination showed that tebuconazole had the best inhibitory effect， followed by difenoconazole， pyraclostrobin， prochloraz and thiram; the inhibitory effects of fluxapyroxad and thiophanate-methyl were different obviously among different regions.

KeywordsStrawberry; Root rot; Isolation; Identification; Virulence determination

草莓（Fragaria ananassa Duchense）为多年生宿根性草本植物，具有较高的经济价值。近些年草莓产业发展迅速，随着栽培面积日益增长，连作导致的土传病害越来越严重，尤其是根腐病，严重影响草莓品质和产量，已经成为制约产业发展的关键因素。草莓根腐病主要危害茎基部和根部，严重时可造成整个草莓园的毁灭。

草莓根腐病是国内外草莓生产中难以防治的根部毁灭性病害，主要由镰刀菌（Fusarium sp.）[1-3]、腐霉菌 （Pythium sp.）[4]、疫霉属 （Phytophthora spp.）[5]、立枯丝核菌 （Rhizoctonia solani）[6， 7]、擬盘多毛孢菌 （Pestalotiopsis sp.）[8]以及炭疽菌属（Colletotrechum sp.）[9， 10]等20多种土传病原真菌复合侵染导致[11]。近些年研究者开始利用生防菌防治草莓根腐病，如木霉 （Trichoderma spp.）[12]、沙雷氏菌（Serratia plymuthica）[13]等，但是生产中草莓根腐病的防治仍然以化学防治为主。

不同地区不同品种草莓根腐病病原菌种类不尽相同，且随着化学农药的频繁使用，病原菌抗药性增强。因此全面了解天津地区草莓根腐病的病原菌种类及其对常用化学药剂的抗性水平尤为重要。本研究对天津市主要草莓基地根腐病病原菌进行分离鉴定，并对病原菌抗药性水平进行测定，以期为天津市草莓生产提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

草莓根腐病病样于2017—2018年采集于天津市汉沽区大马勺村、西青农博园、东丽区华明镇、蓟州区等主要草莓基地。

1.2病原菌的分离与纯化

采用常规组织分离法，将新鲜的草莓根腐病病根冲洗干净，剪取病健交界处0.5 cm节段，用0.5%次氯酸钠浸泡30 s，无菌水清洗3次，灭菌纸吸干水分后用镊子将其置于含有0.1 g·L-1氨苄青霉素的PDA培养基上，放入培养箱中培养3～4 d，待长出菌丝，单孢纯化，分离得到的菌株保存备用。

1.3病原菌分子鑒定

将病原菌接种到PDA培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。待长出菌丝后，用CTAB法提取总DNA。采用真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4[14] 进行PCR扩增（ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR体系为：2×Es Taq Master Mix（Dye）25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH 2O 19 μL。扩增程序为：94℃ 4  min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，共35个循环;72℃ 10 min。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后送天津金唯智生物科技有限公司测序。测序结果采用BLAST进行同源性分析。

1.4病原菌室内毒力测定

供试药剂：100%氟唑菌酰胺，巴斯夫中国有限公司;98%吡唑醚菌酯，陕西美邦农药有限公司;97%咪鲜胺，江苏辉丰生物农业股份有限公司;96%戊唑醇、95.2%苯醚甲环唑，宁波三江益农化学有限公司;97%甲基硫菌灵，山东潍坊润丰化工股份有限公司;98%福美双，天津市农药研究所。

病原菌室内毒力测定采用菌丝生长速率法。配制系列梯度浓度的含药剂PDA平板，以等体积无菌水为对照。将培养好的病原菌菌块（直径5 mm）接种到上述平板上，恒温25℃培养4 d，每个处理3个重复。采用十字交叉法测定菌落直径，记录并计算相对抑菌率。

1.5数据处理

试验结果用DPS数据软件进行处理，计算不同药剂的毒力回归方程、相关系数、致死中浓度EC 50值等。采用MEGA 5.0软件对真菌ITS序列进行遗传分析。

菌丝生长抑制率（%）=（空白对照菌落直径增加值-药剂处理菌落直径增加值）/空白对照菌落直径增加值×100[HT]

2结果与分析

2.1草莓根腐病形态学鉴定

根据病原菌在PDA培养基平板上菌落形态（图1）及其菌丝和孢子形态（图2），可以初步确定草莓根腐病病原菌为炭疽菌属和镰刀菌属真菌。

2.2草莓根腐病病原菌分子鉴定结果

将测序结果进行BLAST序列比对，其中HG-1、HGDMS-3、DLHMZ-5、XQNBY-6四个菌株的序列与胶孢炭疽菌 （Colletotrichum gloeosporioides，DQ916151.1）相似性为99%～100%，HG-2、HGDMS-4、JZ-7三个菌株的序列与尖孢镰刀菌 （Fusarium oxysporum f. sp. dianthi，LT841236.1）相似性为99% ～ 100%（图3）。因此天津地区草莓根腐病病原菌主要是胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌。

2.3草莓根腐病抗性测定

试验筛选的7种杀菌剂对胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌均有不同程度的抑制作用，其中戊唑醇的抑菌活性最好（表1）;其次是苯醚甲环唑、咪鲜胺、吡唑醚菌酯、福美双;氟唑菌酰胺和甲基硫菌灵对不同地区菌株的抑菌活性差异较大，可能由于近几年该杀菌剂在一些地区频繁应用产生了一定的抗性。

3讨论与结论

随着草莓种植规模的日益扩大，种植年限增加，草莓根腐病已成为生产上难以解决的重要问题。目前以化学药剂防治为主，但是由于草莓根腐病病原菌种类繁多，在制定综合防治措施以及确定化学药剂时，首先应明确主要病原菌的种类。

草莓根腐病致病因子极为复杂，各地区不同品种草莓致病菌的报道不尽相同。咸俊男等发现北京房山区草莓根腐病的主要病原菌为立枯丝核菌，化学药剂甲基硫菌灵和杀毒矾、生物菌剂枯草芽孢杆菌、哈茨木霉和寡雄腐霉均对其具有较好的抑制作用[15]。韩国兴测定了建德市杨村桥镇的草莓胶孢炭疽菌对14种杀菌剂的抗药性水平，其中代森锰锌和吡唑醚菌酯的防治效果最好[16]。烟台地区草莓根腐病病原菌包括尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和疫霉菌（Phytophthora sp.），其中尖孢镰刀菌和立枯丝核菌最为普遍[17]。Gerin等发现壳球孢菌（Macrophomina phaseolina）可引起草莓根腐病的发生，损失惨重[18]。

本试验通过菌株形态学和分子生物学方法明确了引起天津地区草莓根腐病的病原菌主要为胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）和尖孢镰刀菌（F. oxysporum），并测定了7种常用药剂对天津地区草莓根腐病病原菌的敏感性，为天津地区草莓优质安全生产提供了一定的参考依据。

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