加味神术散雾化对FM1感染小鼠NLRP3炎症小体及下游炎性因子表达的影响

李继庭，梁虹宇，苏立芬

（1.广东省第二中医院，广东 广州 510095；2. 广东省广州市白云区人民医院，广东 广州 510500）

流行性感冒是由流感病毒诱发的急性呼吸系统传染性疾病，临床采取流感疫苗仅能预防某些特异性病毒，但无法阻止病毒的不断变异［1］。中药雾化吸入具有芳香辟秽、直祛病邪、经络传导以及固护正气等功效［2］。本研究用治疗瘟病的经典方药神术散经加味后制为雾化剂进行实验，探究加味神术散雾化对FM1感染小鼠NLRP3炎症小体及下游炎性因子表达的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

药品。加味神术散（苍术、白芷、甘草、金银花、野菊花、羌活、藿香、冰片），购自广东省第二中医院。取15剂水煮蒸馏，浓缩后获得黄色精油，采用乙醚将油反复溶出，加无水Na2SO4脱水干燥，用维持液将药物混悬并超声以备用。利巴韦林喷雾剂（史达德药业有限公司，生产批号20171120）。

病毒毒种。甲1型流感病毒FM1鼠肺适应株，由广州中医药大学热研所病毒室提供。病毒经小鼠增强毒力后，于鸡胚尿囊腔常规传代培养2次，分装，-70℃保存备用。

仪器和试剂。电子天平，F A 2 0 0 4 N购自上海精密仪器科学有限公司；全自动真空组织脱水机，LeicaASP300S，德国Leica公司；超净工作台，型号SB-7C-1B，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；高压蒸汽灭菌器，型号YX280A，上海三申医疗器械有限公司；Shandon包埋机、Shandon手动切片机、Shandon全自动染色机，英国Shandon公司；倒置显微镜，BX-50，日本OLYMPUS公司；超低温冰箱，ThermoForma，美国电热集团（ThermoElectronCorporation）；电热恒温水浴锅，DK-S22，上海精宏实验设备有限公司；酶标仪，powerwave340，美国Bio-tek公司；高速匀浆机，IKAT10basicS25，德国IKA公司；隔水电热恒温培养箱，PYX-DHS-SOX，上海跃进医疗器械厂；高速冷冻离心机，HERMLE-z323k，德国HERMLE公司；TaKaRa试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司；R&DELISA试剂盒，厦门研科生物技术有限公司；麻醉缸、电子称、眼科剪、镊子、玻璃瓶、烧杯、烧瓶。一次性注射器、移液器吸头等由广州中医药大学实验室提供。

1.2 动物

实验小鼠的选择和喂养。SPF级NIH小鼠80只，体质量13～15g，雌雄各半，小鼠由广州弗尔博生物科技有限公司提供［货号J022，医动字第28-2023号，合格证编号SCXK（京）2018-0011］。分笼饲养，小鼠使用的笼具、饲料及垫料等均高压消毒，喂养自来水和标准实验小鼠饲料，能够正常自由饮食饮水，白天光照时间和黑暗时间各12h。小鼠应用物品每隔3日进行消毒，适应性喂养7日。鼠房内备有空调以及排气扇，实验室温度维持（23±1）℃，相对湿度（75±10）%，饲养过程达到SPF级标准。

2 实验方法

模型复制［3］。进行感染小鼠造模，在麻醉缸内，用乙醚将小鼠轻度麻醉，正常对照组予以50mL0.9%生理盐水滴鼻，其余各组均予以流感病毒稀释液50mL滴鼻以感染小鼠造模。

分组和给药。NIH小鼠采用随机数字分配法分为正常组、利巴韦林组、病毒对照组、神术散雾化组共4组，每组20只。给药剂量按动物每公斤体质量占人体表面积的比值计算。利巴韦林组予以利巴韦林0.13g/（kg·d），神术散雾化组予以加味神术散1.50g/（kg·d），正常对照组以及病毒对照组应用与神术散雾化剂组体积相同的0.9%生理盐水。造模前2日给药，给药第3日在病毒接种1h后继续给药。将各组药物原液稀释成所需浓度，各组小鼠经咽部喷雾，连续给药7日。每日喂养全价饲料，自由饮水。

3 观察指标

咽部黏膜匀浆制作方法。滴鼻病毒感染后第5日，末次给药24h后采取脱椎处死小鼠。其中每组10只获得咽部黏膜，PCR样品保存液保存，用于实时荧光定量PCR检测；另外每组10只取咽部黏膜于低温条件下，根据常规方法制备黏膜匀浆［黏膜重（g）/生理盐水（mL）=1/9］，采取4℃2500r/min离心30min后获取上清液，放-20℃冰箱中保存，以待ELISA检测应用。

荧光定量P C R检测咽部黏膜组织中N L R P 3、caspase-1的mRNA表达。采用TRIzol裂解获得咽部黏膜组织，经氯仿抽提→异丙醇沉淀→75%乙醇洗涤→DEPC水溶解→分光光度计测定RNA含量以及纯度处理。cDNA合成以及均参考TaKaRa试剂盒说明书进行，引物序列和反应条件。

IL-1β、IL-18水平检测。采用R&DELISA试剂盒对咽部黏膜匀浆IL-1β、IL-18水平进行检测，严格按说明书进行。

统计学方法。采用 SPSS19.0 统计软件进行统计学分析，计量资料以（±s）表示、用t检验，计数资料以（%）表示、用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

4 治疗结果

4.1 各组咽部黏膜NLRP3、caspase-1的mRNA相对表达量比较

与正常对照组比较，病毒对照组、利巴韦林组及神术散雾化组NLRP3、caspase-1的mRNA相对表达量较高（P＜0.05）；与病毒对照组比较，利巴韦林组及神术散雾化组NLRP3、caspase-1的mRNA相对表达量较低（P＜0.05）；与利巴韦林组比较，神术散雾化组NLRP3、caspase-1的mRNA相对表达量较低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组咽部黏膜NLRP3、caspase-1的mRNA相对表达量比较 （±s）

表1 各组咽部黏膜NLRP3、caspase-1的mRNA相对表达量比较 （±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与病毒对照组比较，#P＜0.05；与利巴韦林组比较，△P＜0.05.

images/BZ_7_1287_358_2253_422.png正常对照组 20 1.01±0.14 1.00±0.06病毒对照组 20 2.58±0.21* 2.94±0.42*利巴韦林组 20 1.22±0.13*# 1.36±0.18*#神术散雾化组 20 1.11±0.10*#△ 1.11±0.07*#△

4.2 加味神术散雾化对咽部黏膜匀浆IL-1β、IL-18的水平影响

与正常对照组比较，病毒对照组、利巴韦林组及神术散雾化组IL-1β、IL-18水平较高（P＜0.05）；与病毒对照组比较，利巴韦林组及神术散雾化组IL-1β、IL-18水平较低（P＜0.05）；与利巴韦林组比较，神术散雾化组IL-1β、IL-18水平较低（P＜0.05）。见表2。

表2 加味神术散雾化对咽部黏膜匀浆IL-1β、IL-18分泌水平的影响 （pg/mL，±s）

表2 加味神术散雾化对咽部黏膜匀浆IL-1β、IL-18分泌水平的影响 （pg/mL，±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与病毒对照组比较，#P＜0.05；与利巴韦林组比较，△P＜0.05.

images/BZ_7_1287_1189_2254_1261.png正常对照组 20 20.29±2.12 36.67±2.49病毒对照组 20 55.30±5.73* 94.21±5.18*利巴韦林组 20 36.29±3.89*# 71.70±5.01*#神术散雾化组 20 25.40±2.85*#△ 63.50±4.09*#△

5 讨 论

中医治疗流感的有效性在临床和实验研究中获得证实［4］，中医的“内病外治”法历史悠久，是中医不可或缺的部分。随着当今医疗模式的转变和“以人为本”医疗理念的深化，中医外治法因其便捷、有效以及安全等优势受到广大医疗学者的重视，近几年中医外治法逐步在临床疫病防治中推广。神术散出自《杨氏家藏方》，收录于《太平惠民和剂局方》，用于治疗四时瘟疫，头痛项强，发热憎寒，身体疼痛及伤风鼻塞，是瘟病犯卫的经典方。本研究在原方基础上加入金银花、野菊花以及冰片（苍术、羌活、金银花、白芷、藿香、野菊花、冰片、甘草）。方中苍术燥湿健脾、祛风散寒、明目，白芷、羌活疏风散寒、散寒燥湿，藿香理气和中、辛温散寒，金银花、野菊花清热解毒，冰片透内热、散郁火、避秽化浊，甘草调和诸药。诸药合用，可避秽化浊、透邪外出，发挥良好的疫病防治作用［5］。

NLRP3炎性小体由NLRP3、Caspase-1及衔接分子凋亡相关点样蛋白（ASC）结合构成。正常机体NLRP3活性处于抑制状态，在NLRP3配体和NLRP3的LRR相结合后促进热休克蛋白分泌，NLRP3的NOD结构域存在自身寡聚化，致使其热蛋白结构域（PYD）与ASC结合，并通过ASC的胱天蛋白酶招募结构域招募并激活Caspase-1，IL-1β、IL-18为Caspase-1的下游炎性因子，Caspase-1活化后使IL-1β、IL-18前体加工为成熟且有活性的形式，分泌于细胞外产生免疫作用。研究认为，NLRP3能感知胞内病原微生物和代谢物，是启动和构成炎性复合体的重要成分［6］。Caspase-1是IL-1β、IL-18成熟有活性的转化酶，是NLRP3炎性小体的效应蛋白。研究显示，FM1感染小鼠的NLRP3及Caspase-1的表达量及其下游炎性因子IL-1β、IL-18存在显著意义，上述因子水平均远高于正常对照组小鼠，并发现NLRP3炎性小体在FM1感染的发生发展中具有重要作用［7］。研究结果显示，神术散雾化组NLRP3、caspase-1的mRNA相对表达量、IL-1β、IL-18远低于病毒对照组、利巴韦林组，提示加味神术散雾化可能通过下调NLRP3炎症小体及下游炎性因子表达。

加味神术散雾化能下调NLRP3炎性小体及其下游因子IL-1β、IL-18的分泌水平，对流感病毒FM1感染小鼠具有免疫保护作用。从分子生物学水平分析其抗流感病毒的有效性，为加味神术散雾化治疗流感的临床应用提供了理论支持。