松果菊苷对帕金森病模型大鼠纹状体内质网应激相关凋亡蛋白ASK1的影响

钟佳男，唐岚芳，刘 婷，杨莎莎，陈乃洁，蔡 晶，肖绍坚

（1.福建中医药大学2017级硕士研究生，福建 福州 350122；2.福建中医药大学附属第三人民医院，福建福州 350122；3.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是常见的老年中枢神经系统慢性退行性疾病，其病理改变主要是黑质-纹状体多巴胺神经元的变性坏死[1]。研究发现，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是PD发病机制之一。适当的ERS能够协助细胞维持内质网的稳态，但持续或过度的ERS可诱发ERS相关细胞凋亡[2]。凋亡信号激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）的激活是ERS引起细胞凋亡的关键因素[3]。研究表明，持续过度的内质网应激引起细胞凋亡与其激活特异性凋亡介质caspase-12有关[4]。课题组前期研究表明中药肉苁蓉能改善帕金森病模型大鼠的行为障碍，对帕金森病模型大鼠的神经元起到保护作用[5]。本研究通过观察松果菊苷对PD模型大鼠行为学及ERS相关蛋白ASK1、caspase-12的影响，进一步探讨其防治PD的作用机制。

1 材 料

动物。SPF级成年雄性SD大鼠，体质量215～245g，由福建中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（沪）2018-0004。福建中医药大学实验动物中心提供普通级医学实验动物环境设施，许可证号：SYXK（闽）2014-0005。

试剂。松果菊苷购自中国南京景竹公司，将松果菊苷粉末加入纯水中稀释成2mg/mL的松果菊苷水溶液，4℃下低温避光保存。鱼藤酮注射液取鱼藤酮粉末（美国Sigma公司），加葵花油（美国Sigma公司）稀释成1.5mg/mL的鱼藤酮葵花油液，4℃下低温避光保存。ASK1抗体（英国abcam公司）、caspase-12抗体（英国abcam公司）、β-actin抗体（武汉三鹰公司）。

仪器。5417R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），转膜仪与电泳槽（美国Bio-Rad公司），凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司），DU-650型蛋白分析仪（美国Beckman公司）。

2 方 法

2.1 PD模型的建立及分组

每组取8只SD大鼠，采用大鼠颈背部皮肤下注射鱼藤酮葵花油造模法[6-7]，模型组与治疗组大鼠颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳液（0.1mL/100g×d），连续注射14天，建立PD模型。溶剂对照组大鼠按照颈背部皮下注射葵花油（0.1mL/（100g×d）连续注射14天；正常组不予处理。

2.2 干预方法

造模结束后，治疗组予松果菊苷水溶液1mL/（100g×d）灌胃，连续治疗2周。其余组予纯水1mL/（100g×d）灌胃，连续2周。

2.3 行为学分析

治疗组给药前1天、给药第14天分别做行为学步幅试验，装置1个木盒子（长40cm，宽5cm，高12cm），1条跑道（长44cm，宽5cm），并且将跑道穿过，不透光木盒。在跑道上放上白纸（长44cm，宽5cm），然后将大鼠的左、右前爪分别涂上黑色、红色墨水，刺激大鼠在白纸跑道上行走并且穿过木盒子，分别测量白纸上大鼠的黑色、红色墨水印记前后之间的距离，并记录其中最长距离（对应大鼠的最快速度），大鼠在行走过程中停止或者有明显减速的结果要排除，并且重新测试，每只大鼠步幅试验需重复测量3次，结果取平均值。

2.4 取材

在松果菊苷干预14天后开始取材。大鼠腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后，断头取脑，将脑置于冰盘迅速取出纹状体（正中线旁开3 mm，前囟前1 mm，硬膜下4.5 mm），再用0.9%氯化钠溶液（提前置于-4℃冰冻处理）洗净组织中血液，滤纸吸干后存放于-80℃冰箱。

2.5 Western blot检测

组织称重后加组织裂解液（12.5 µL/mg）并在低温环境下充分研磨，置于4℃离心机中离心15 min（12000 r/min），抽取上清液后用BCA法检测蛋白浓度。将样品置于沸水中加热10 min使蛋白充分变性。配胶、上样、电泳、转膜、脱脂，封闭2 h后加入提前配制的ASK1、caspase-12抗体液中（抗体∶抗体稀释液=1∶1000），4℃过夜。次日TBST洗膜，加入二抗（抗体∶抗体稀释液=1∶10000），室温孵育1h后再次洗膜。ECL发光显色检测：加入显色剂，置于成像仪内曝光成像，用ImageLab软件分析后并记录条带灰度值。

2.6 统计学方法

实验数据用SPSS23.0软件进行分析。计量资料用（±s

）表示，组间比较行单因素方差分析，组间两两比较方差齐采用LSD法，方差不齐则采用Games-Howell法。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 行为学检测结果

造模后14天，与正常组比较，模型组及治疗组步幅缩短（P＜0.05），溶剂对照组与正常组步幅相近（P＞0.05）。给药14天，与正常组比较，模型组的步幅缩短（P＜0.05）；与正常组比较，治疗组步幅缩短（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组步幅的长度有所增加，但无统计学意义。见表1。

表1 药物干预前后各组老鼠步幅试验比较 （cm，±s）

表1 药物干预前后各组老鼠步幅试验比较 （cm，±s）

注：与正常组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05。

组别 松果菊苷给药前1天 松果菊苷给药第14天正常组 14.59±1.21# 13.96±1.83#溶剂对照组 13.63±0.73# 13.53±0.55#模型组 10.45±1.03* 10.66±1.13*治疗组 10.33±0.91* 11.86±1.21*

3.2 Western blot检测纹状体ASK1、caspase-12蛋白表达

与正常组比较，模型组中ASK1、caspase12蛋白表达增加（P＜0.05）。与模型组比较，治疗组ASK1、caspase-12蛋白表达减少（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠纹状体中ASK1、caspase-12蛋白表达比较 （±s）

4 讨 论

帕金森病是一种慢性进行性疾病，是第二大常见的神经退行性疾病。由于PD病情的进展和耐药性的产生，很多神经保护治疗效果不佳[8]。

PD属中医“颤证”范畴。《医宗己任编》记载：“大抵气血俱虚，不能荣养筋骨，故为之振摇，而不能主持也”，阐述了本病以肢体震颤为主症，认为气血亏虚，精髓亏损，无以充养脑窍、筋骨所致，“振摇不止”的根本在于肾虚精亏。《医学衷中参西录》云：“人之脑髓空者，……知觉运动俱废，因脑髓之质，原为神经之本源也。”首次指出肢体运动功能障碍与脑精衰少有关，而脑之精髓本源在肾，肾气盛则精足气旺，聪明灵动，筋骨强劲，动作敏捷；若肾气不足，则神识不清，头摇肢颤，筋脉拘紧，持物不稳。

肉苁蓉性味甘温，可补肾益精，主治肾虚精亏。研究发现，肉苁蓉等中药制剂对PD模型动物具有神经保护作用[9]。肉苁蓉颗粒对帕金森病模型大鼠黑质纹状体的多巴胺能神经元具有保护作用[10]。其主要成分松果菊苷能逆转PD模型大鼠纹状体及海马细胞外液中的单胺类神经递质的含量降低[11]，并可通过GRP94/BIP-ATF4-CHOP信号通路缓解ERS[12]。

持续的内质网应激可激活凋亡信号通路，肌醇需求酶1（Ire1α）通路介导的凋亡途径和 caspase-12途径为其中重要的通路。一方面内质网应激发生时可激活Ire1α，进而激活凋亡关键蛋白ASK1，最终促进细胞凋亡。另一方面caspase-12可被异常的ERS激活并进一步激活其下游的凋亡执行因子caspase-3，从而独立地介导细胞凋亡。

研究发现松果菊苷治疗后，PD模型大鼠的行为学步幅距离较模型组有所延长，但差异无统计学意义，说明松果菊苷能改善PD模型大鼠部分运动协调能力。Western blot检测显示，松果菊苷组PD模型大鼠较模型组ASK1蛋白与caspase-12蛋白表达明显降低，表明松果菊苷能逆转PD模型大鼠部分ERS相关凋亡蛋白表达，对PD模型大鼠神经元功能有一定的保护作用，其机制可能是通过抑制IRE1a-ASK1-JNK通路与caspase-12途径来阻止异常ERS。