纳他霉素发酵液提取工艺研究

于少滨

摘  要：本文对纳他霉素发酵液的提取工艺进行研究。最佳提取工艺为提取温度为25摄氏度，乙醇体积分数为75%，PH值10-11。检测方法为流动相：甲醇-水-冰醋酸（55：40：5），检测波长：302nm，流速：1.0m·min-1。柱温：30℃。测定方法可用于纳他霉素发酵液中纳他霉素的含量测定。

关键词：纳他霉素发酵液;提取;研究

纳他霉素为近白色或奶油黄色结晶粉末，纳他霉素（Natamycin）是一种由链霉菌发酵产生的天然抗真菌化合物，属于多烯大环内酯类。既可以广泛有效的抑制各种霉菌、酵母菌的生长，又能抑制真菌毒素的产生，低剂量且安全性高的食品防腐剂[1-3]。纳他霉素的作用机理是与真菌的麦角甾醇以及其他甾醇基团结合，使细胞膜畸变，最终导致渗漏，引起细胞死亡，对细菌没有抑制作用。本文对纳他霉素发酵液的提取工艺进行研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HZY-404/503实验室电子天平（浙江景程生物科技有限公司）;电热恒温水浴锅-DU-30（杭州汇尔仪器设备有限公司）;0L-50L大型旋转蒸发仪（北京赛美思仪器设备有限公司）;双光束紫外可见分光光度计-UV1900（杭州汇尔仪器设备有限公司）;TGL20MW台式大容量高速冷冻离心机（湖南赫西离心机仪器有限公司）;加热磁力搅拌器（郑州南北仪器设备有限公司）;MOLPW医药生物行业用超纯水系统（上海摩勒科学仪器有限公司）;1UWB-6恒温水浴箱（北京优晟联合科技有限公司）;SB-3200DTD上海净信超声波清洗机（衢州新芝生物科技有限公司）。

1.2 色谱柱

安捷伦 十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（218mm×4.6mm，5μm）。

1.3 对照品

纳他霉素 購自中国药品生物制品检定所。

1.4 试剂

甲醇（东营市鑫旺化工有限责任公司）、乙腈（东营市鑫旺化工有限责任公司）、冰醋酸（东营市鑫旺化工有限责任公司）。

2 提取工艺的研究

2.1 制备方法

将纳他霉素发酵液调PH值10-12，经75%乙醇提取后离心分离。

2.2 正交试验

本实验采用提取温度、乙醇体积分数、PH值作为考察因素，采用正交试验法对影响提取效率的其它工艺条件进行优选。采用3个考察水平，用L9（34）正交表进行试验，因素水平表见表1。

3 含量测定

3.1 流动相的选择

分别考察甲醇-水-冰醋酸（68：30：2），甲醇-水-冰醋酸（55：40：5）， 甲醇-乙腈-水-冰醋酸（30：20：50：0.1），甲醇-水-醋酸（50∶50∶1），水-甲醇-冰醋酸（50∶50∶0.02）不同比例的流动相，结果以甲醇-水-冰醋酸（55：40：5）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用甲醇-水-冰醋酸（55：40：5）为流动相。

3.2 检测波长的选择

制备纳他霉素对照品稀释液照紫外-可见分光光度法（中国药典2010版一部 附录Ⅴ A），于190～900nm波长范围内进行全波长光谱扫描，记录吸收光谱。在302nm处有最大吸收峰，故选用302nm为检测波长。

依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[4-6]。流动相：甲醇-水-冰醋酸（55：40：5）检测波长：302nm，流速：1.0m·min-1。柱温：30℃。理论板数按纳他霉素峰计算应不得低于2000。

3.3 对照品溶液的制备

精密称取在100℃减压干燥至恒重的纳他霉素对照品，加流动相制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

3.4 供试品溶液的制备

取纳他霉素发酵液，加甲醇适量，超声处理5分钟，高速离心二十分钟，过滤，放置至室温，加流动相稀释至100毫升，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。

3.5 专属性试验

取纳他霉素发酵辅料按样品制备工艺制成阴性对照样品，照3.4项下供试品溶液的制备方法制成阴性液，依上述方法测定，结果在纳他霉素出峰处阴性液无色谱峰，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。

3.6 对照品的线性考察

精密称取100℃减压干燥至恒重的纳他霉素对照品50mg，置100ml容量瓶中，加入流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取1、2、3、4、5mL，置于10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。分别精密上述溶液吸取10μL，注人液相色谱仪，依照3.2项下的色谱条件测定，记录色谱峰。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明，纳他霉素在50～250μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

4 讨论

实验结果表明提取温度为25摄氏度，乙醇体积分数为75%，PH值10-11时纳他霉素提取效果最好。测定方法可用于纳他霉素发酵液中纳他霉素的含量测定。新制备工艺使纳他霉素的含量提高了为原来的1.2倍。

参考文献

[1]李听听，陈伟，卢中一，李广富.那他霉素复配防霉剂对储藏小麦真菌多样性和品质影响[J].中国粮油学报，2015（05）.

[2]魏杰，宋威，张国坤，张潇.金褐霉素和纳他霉素对冬枣品质及代谢相关酶的影响[J].食品科学技术学报，2015（05）.

[3]刁静静.肉类保藏技术（十二）生物防腐剂在肉品保鲜中的应用（一）——乳酸链球菌素和纳他霉素[J].肉类研究，2009（03）.

[4]陈永艳，李彩瑞，杨秀敏，宋双居，王志.高效液相色谱法测定果酱中的纳他霉素[J].中国食品学报，2008（01）.

[5]Rapid ultraviolet spectrophotometric and liquid chromatographic methods for the determination of natamycin in lactoserum matrix. Capitán-Vallvey L F，Checa-Moreno R，Navas N，Capitán-Vallvey L F，Checa-Moreno R，Navas N. Journal of AOAC International. 2000.

[6]骆健美，金志华，岑沛霖.RP-HPLC法测定发酵液中纳他霉素含量[J].中国抗生素杂志，2004（11）.