桑叶对大鼠血液生化指标和组织病理学的影响

蔡 明，牟 兰，刘建勇，王宗礼，黄必志

（1. 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020；2. 云南省草地动物科学研究院，云南 昆明 650212；3. 中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032）

桑(Morus alba)是桑科桑属植物，原产于中国的中北部，具有较强的适应性和抗逆性[1-2]，栽培范围广泛，现已扩展到东亚、东南亚、欧洲、非洲、美洲等世界大部分地区。中国“种桑养蚕”历史悠久，传统蚕丝业在很长的一段历史时期内对中国丝绸之路的发展及在对外贸易中起着极其重要的作用，至19世纪80年代后期，丝绸居中国出口商品第一位。目前，中国已成为世界最大的蚕丝出口和生产国，贸易量占全球的80%。近几年，随着纺织新技术的改进、各种纺织新材料的冲击，世界丝绸市场的萎缩，导致蚕桑市场波动较大，风险较高。传统蚕丝业受到严重影响，中国家蚕养殖逐年减少，大量桑叶闲置或焚烧。据测算，蚕桑资源的利用率只有总生物量的1%～3%，蚕农和桑农利益受损。传统的种桑养蚕模式亟需新的转型和多样化发展。有试验表明，桑叶粗蛋白含量较高(占干物质的20%左右)，营养成分丰富，适口性较好，且富含多种脂肪酸、矿物质、维生素和适宜的生物活性物质[3-6]。据统计，中国南方的桑园面积占了全国的68.9%，加之中国连续多年“东桑西移”政策的实施，目前桑园主要分布在广西、四川和云南等亚热带地区。这些桑资源如能加工饲用，不仅能避免因焚烧造成的污染，而且能够有效缓解优质蛋白饲草资源冬春季短缺的局面，促进中国畜牧业的健康持续发展，取得良好的经济、社会和生态效益。因此，桑叶在畜禽饲料化开发利用方面具有极大的潜力。

目前已有一些桑叶应用于水产、家禽和家畜养殖，并产生了良好效益的报道[7-8]。但桑叶除了富含多样的营养物质之外，还存在抗营养因子和部分活性物质等不利于动物生产的因素，因此在饲喂过程中如不注意量的控制，有可能产生不利影响[9-10]。目前，对于桑叶的饲用安全性、抗营养因子降解和饲料加工调制方面的系统研究还较少。

本研究采用SD大鼠(Sprague-Dawley rats)经口灌胃桑叶受试物28 d，恢复14 d，观察桑叶对大鼠血液生化、组织器官及其病理学指标变化的影响，探讨其剂量-反应关系，判定桑叶最大未观察到有害作用剂量(NOAEL)，以期为桑叶的饲用安全性提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选择年龄5～7周的体重150～220 g的SD大鼠60只，许可证号SCXK(滇)K2015-0002。雌雄各半，分开饲养。笼内采用灭菌玉米芯垫料，每周更换两次，笼具洗刷消毒。饲养环境温度20～26 ℃，湿度40%～70%。

日粮饲喂 SPF(specific pathogen free)级大鼠生长繁殖饲料，生产许可证号SCXK(京)2012-0019。试验过程中SD大鼠不限饮水，饮用水为净化自来水。试验动物的使用遵循动物福利政策和相关要求。

SD 大鼠适应期为 7 d，灌胃期 28 d，恢复期 14 d。以单次灌胃最大药量(桑叶最大可配制浓度与最大灌胃容积的乘积)为高剂量，向下减半设置为低剂量。将桑叶风干并研磨成粉末状，将其与蒸馏水和1%羧甲基纤维素钠水溶液混合，共设置3个处理组 (T1，溶媒对照组；T2，1 g·kg-1；T3，2 g·kg-1)，每组20只SD鼠(雌雄各半，分开饲养)，每日每组灌胃 1 次，持续 28 d，灌胃容积 20 mL·kg-1。

1.2 血液生化指标和脏器系数测定

灌胃期结束，每组随机选取约2/3大鼠进行采血，用西门子DimensionEXL200全自动生化分析仪检测其血液生化指标，并解剖摘取心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、胸腺、脾脏、肺、睾丸(雄性)、附睾(雄性)、卵巢(雌性)、子宫(雌性)称重，进行脏器系数计算。剩余大鼠停止灌胃恢复14 d，恢复期结束对剩余SD大鼠进行相同指标测定。

1.3 组织病理学观察

灌胃期结束，对T1溶媒对照组和T3高剂量组约2/3大鼠进行解剖检查，观察组织器官有无明显的病理变化。并摘取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、肠放在10%中性福尔马林固定液固定1周。采用Leica EG1160包埋机进行石蜡包埋，Leica RM2255 切片，Leica ST5020 染色机 + Leica CV5030盖片机连机进行HE染色盖片，Leica DM2500显微镜配合图像分析系统进行图片采集，观察记录其组织学变化。恢复期结束，对T1溶媒对照组和T3高剂量组剩余大鼠进行同样的病理观察。如T3高剂量组检测发现明显组织脏器病变异常，则再对T2低剂量组进行相关检测。

1.4 数据统计与分析

用 SPSS 17.0 for Windows统计软件，One-way ANOVA进行方差分析，差异显著时采用Duncan法进行多重比较，试验结果以平均值 ± 标准差表示，并标注显著水平。

2 结果与分析

2.1 桑叶对大鼠血液生化指标的影响

灌胃期结束时，与T1溶媒对照组相比，T2低剂量组、T3高剂量组各项血液生化指标均显著差异(P＞0.05)(表1)。恢复期结束时，各剂量组与T1溶媒对照组相比，T2、T3处理组仅有尿素氮 (blood urea nitrogen, BUN) 出 现变化 (表 2)。T2低剂 量 组 BUN升高 (P= 0.002)，T3高剂量组 BUN 降低 (P= 0.026)，但该变化趋势无剂量相关性且变化幅度较小，属于正常的试验波动。其余各指标无显著差异(P＞0.05)。

2.2 桑叶对大鼠脏器系数变化的影响

灌胃期结束时，与T1溶媒对照组相比，T2低剂量组、T3高剂量组雌、雄性大鼠各器官脏器系数均无统计学差异 (P＞0.05)(表 3、表 4)。恢复期结束时，与T1溶媒对照组相比，仅雌性大鼠的低剂量组肺系数、肝脏和脾脏系数降低(P＜0.05)(表5)。雄性大鼠各器官脏器系数与T1溶媒对照组相比均无显著差异 (P＞0.05)(表 6)。

2.3 桑叶对大鼠主要脏器的病理学影响

2.3.1 循环系统

心脏(灌胃期和恢复期结束)，T1溶媒对照组和T3高剂量组大鼠均未见明显病理改变(图1)。

2.3.2 呼吸系统

肺(灌胃期和恢复期结束)，局部肺间质增宽，肺组织内部分肺泡壁增生，其内可见不同程度的淋巴细胞为主的炎细胞浸润(图2)。

2.3.3 消化系统

胃(灌胃期和恢复期结束)，T1溶媒对照组及T3高剂量组大鼠均未见明显病理改变(图3)。小肠(灌胃期和恢复期结束)，小肠粘膜固有层内淋巴细胞浸润(图4)。肝脏(灌胃期和恢复期结束)，肝细胞点灶状坏死，中央静脉周围炎细胞浸润，汇管区炎细胞浸润(图5)。

2.3.4 泌尿系统

肾脏(灌胃期和恢复期结束) ，间质内钙化点(图6)。

2.3.5 免疫系统

脾脏(灌胃期和恢复期结束)，T1溶媒对照组和T3高剂量组大鼠均未见明显病理改变(图7)。

3 讨论

随着生产力的提高、社会的进步和草牧业的快速发展，人们对肉奶蛋等畜禽产品的需求日益增加，食品安全意识日益增强[11-12]。而优质蛋白饲料短缺、冬春季青绿饲料不足是限制畜禽产品产出和威胁畜禽食品安全的重要因素[13]。桑叶营养丰富，粗蛋白含量高，消化率高，氨基酸平衡，生长季长，具有开发成蛋白饲料源的重要潜力[14-16]。桑叶除富含营养成分外，还含有茉莉酸、花青素、黄酮类化合物、芪类化合物和萜类化合物等生物活性物质[17-18]，具有抑菌、解热、抗癌、抗氧化、降糖、降脂和改善代谢等积极作用[19-20]。但有研究表明，桑叶中的α-葡萄糖苷酶抑制剂，会引起动物腹泻等症状[21]。此外，桑叶中还存在单宁、植酸、氰化物等抗营养因子，会造成部分动物消 化障碍，影响营养吸收，蛋白利用率低，且会对动物生理造成一定的消极影响[22-24]。一般情况下，有机体接触抗营养因子的浓度越低，时间越短，损伤越轻，脱离后也越容易恢复。因此，本研究根据《食品安全国家标准-天经口毒性试验》(GB 15193.22-2014)《饲料毒理学评价-亚急性毒性试验》(GB/T 23179-2008)标准，分别设置了两个时期(灌胃期和恢复期)。一方面以便长期观察桑叶受试物对SD大鼠脏器及组织系统深度的影响；另一方面如若造成不利影响，可观察其机体恢复机能和毒性可逆性。

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表 3 灌胃期桑叶对雌鼠脏器系数变化的影响Table 3 Effect of mulberry leaves on the organ coefficients of female SD rats at the end of the treatment period

表 4 灌胃期桑叶对雄鼠脏器系数变化的影响Table 4 Effect of mulberry leaves on the organ coefficients of male SD rats at the end of the treatment period

表 5 恢复期桑叶对雌鼠脏器系数变化的影响Table 5 Effect of mulberry leaves on the organ coefficients of female SD rats at the end of the recovery period

表 6 恢复期桑叶对雄鼠脏器系数变化的影响Table 6 Effect of mulberry leaves on the organ coefficients of male SD rats at the end of the recovery period

图 1 无桑叶对照组 (T1)和 2 g·kg-1 桑叶处理组 (T3)的 SD 大鼠心肌病理显微图 (HE 10 ×)Figure 1 The pathology micrograph of the heart for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

图 2 无桑叶对照组 (T1)和 2 g·kg-1 桑叶处理组 (T3)SD 大鼠肺病理显微图 (HE 10 ×) (HE 10 ×)Figure 2 The pathology micrograph of the lung for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

图 3 无桑叶对照组 (T1)和 2 g·kg-1 桑叶处理组 (T3)的 SD 大鼠胃病理显微图 (HE 10 ×)Figure 3 The pathology micrograph of the stomach for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

图 4 无桑叶对照组 (T1)和 2 g·kg-1 桑叶处理组 (T3)的 SD 大鼠小肠病理显微图 (HE 10 ×)Figure 4 The pathology micrograph of the small intestine for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

血液生化指标广泛地应用于生命科学研究中， 当动物机体受到刺激或干扰其血液成分均可发生相应变化，严重时会发生病变，进而能够准确反映动物相关器官功能和机体健康状况[25-27]。在灌胃期，各剂量组血液生化指标无显著差异(P＞0.05)。而在恢复期T2低剂量组、T3高剂量组仅有BUN产生变化。BUN不仅能体现蛋白在体内的代谢利用情况而且是反映肾功能的重要指标[28]。当肾脏器官功能受损时，血液中的BUN会升高。本研究中，T2低剂量组增加而T3高剂量组减小，可见，变化趋势无剂量相关性且变化幅度较小，属正常的试验波动。此外，血液学众多指标不是独立的，是互相存在影响的，单一指标数值的变动缺少生物学意义。有研究表明，添加不同比例的发酵桑叶进行肉牛饲喂试验，肉牛的血液生化指标不受影响[29]。这与本研究结果基本一致。脏器质量和系数的变化常能灵敏地反映中毒引起的病变状况(器官增生、萎缩和充血等问题)，当染毒后，动物受损脏器重量会发生改变，能体现动物基本的生物学特征[30]，据此，能估计出器官病变的性质及发生程度。本研究中仅在恢复期时，T2低剂量组雌性大鼠的肺系数、肝脏和脾脏系数降低，其余均无显著差异(P＞0.05)。这属正常个体生理变化，不具统计学意义。

图 5 无桑叶对照组 (T1)和 2 g·kg-1 桑叶处理组 (T3)的 SD 大鼠肝脏病理显微图 (HE 10 ×)Figure 5 The pathology micrograph of the liver for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

图 6 无桑叶对照组 (T1)和 2 g·kg-1 桑叶处理组 (T3)的 SD 大鼠肾脏病理显微图 (HE 10 ×)Figure 6 The pathology micrograph of the renal for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

图 7 无桑叶对照组 (T1)和 2 g·kg-1 桑叶处理组 (T3)的 SD 大鼠脾脏病理显微图 (HE 10 ×)Figure 7 The pathology micrograph of the spleen for the SD rats in T1 and T3 (HE 10 ×)

动物体内的循环系统(心脏)、呼吸系统(肺)、消化系统(肝脏、胃、小肠)、泌尿系统(肾脏)、免疫系统(脾脏)等协调配合，使动物内各种复杂的生命活动能够正常持续进行。本研究在灌胃期和恢复期结束时，大体解剖SD大鼠各组织系统器官用肉眼观察其大小、颜色、质地，均未见与桑叶受试物相关的异常改变。对T1溶媒对照组及T3高剂量组大鼠进行组织病理学镜检时发现，病变主要发生在以下几个系统的脏器：呼吸系统(肺)病变表现为局部肺间质增宽，肺泡壁增生，其内可见不同程度的淋巴细胞为主的炎细胞浸润。消化系统发现病变的器官包括小肠、肝脏。小肠病变表现为粘膜固有层内淋巴细胞浸润；肝脏病变表现为肝细胞点灶状坏死。泌尿系统(肾脏)病变表现为间质内钙化点。经合并病例分析比较，以上病变在T1溶媒对照组与T3桑叶高剂量组之间不存在统计学差异，同时上述各病变程度较轻，数量较少，这些病变情况可视为本研究各剂量组SD大鼠的自发病变，与受试物桑叶饲喂无关。此外，有研究表明，桑葚、桑枝等有助于修复小鼠的肝脏和肾脏器官损伤，对其具有保护功能[31-32]。可见，桑的正常饲喂对SD大鼠无有害影响，这可能由于单宁等抗营养因子在桑叶中存在的量较低或者在SD大鼠消化过程中被降解造成的。但任何饲用植物的使用都应在一个合理的阈值范围内，超出了这个范围就不易发挥正面的作用甚至会产生负作用。桑叶中具体哪种成分的安全性如何，还跟饲喂的动物种类有关，关于其对动物尤其是反刍动物的精确饲喂阈值，还需结合具体的瘤胃微生物环境进行全面评估和深入验证。

4 结论

我国桑园面积广大，虽然具有量和质的优势，但在饲用推广之前，需检验其安全性，进行必要的毒性检验和评价，才能应用于畜牧生产。本研究采用SD大鼠经口灌胃给予桑叶28 d，恢复14 d，SD大鼠血液生化、脏器系数和组织病理学等指标均未见与桑叶受试物相关的异常改变(P＞0.05)。本研究条件下，其无毒性反应剂量(NOAEL)为2 g·kg-1桑叶，初步验证了桑叶的饲用安全性，为进一步合理开发桑叶和毒理学研究提供了一定理论依据。未来在开发过程中需加强对抗营养因子的降解研究，以提供进一步的饲用安全开发参考。