沉默TLR4对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和侵袭的影响

鲍 晓 ，何成松)

1)西南医科大学附属医院风湿免疫科 四川泸州 646000 2)德阳市人民医院风湿免疫科 四川德阳 618000

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一个多种基因、多种细胞因子和多种蛋白酶类共同参与的复杂过程，属于自身免疫性疾病，以滑膜增生、慢性炎症和骨与软骨破坏为主要特征。Toll样受体4(TLR4)是最早发现的Toll样受体家族成员，可通过脂多糖激活NF-κB信号转导通路,介导炎症反应、细胞增殖、侵袭和凋亡等过程，与免疫性疾病的发生发展密切相关[1-3]。越来越多的研究[4-6]显示，滑膜成纤维细胞的异常增殖和侵袭是RA发生发展的重要机制，抑制其恶性增殖和侵袭是改善和控制RA进展的重要手段。已有研究[7]报道，TLR4在RA患者外周血和滑膜组织中异常高表达，并调控NF-κB途径介导的炎症反应。本研究通过RNA干扰沉默人RA滑膜成纤维细胞MH7A中TLR4的表达，观察TLR4沉默对MH7A细胞增殖和侵袭的影响，并探讨其可能的分子机制，以期为深入研究TLR4在RA发生发展中的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1细胞、试剂与仪器MH7A细胞株购于日本Tsukuba公司。DMEM培养基和胎牛血清购于美国Hyclone公司，胰蛋白酶、青链霉素双抗和PBS溶液购于美国Gibco公司，脱脂奶粉购于武汉博士德公司。TLR4抗体购于英国Abcam公司，PCNA、MMP-9和VEGF抗体购于美国Santa Cruz 公司，β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗购于北京博奥森生物公司。脂质体2000、MTT试剂盒、反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购于美国Invitrogen公司。总RNA提取试剂盒购于日本TaKaRa公司。ECL液和BCA蛋白定量试剂盒购于上海碧云天生物公司，总蛋白提取试剂盒购于上海索莱宝公司。PVDF膜购于美国Pirce公司。Transwell小室为美国Costar公司产品，多功能酶标仪和细胞培养箱为美国Thormo公司产品，PCR仪为德国Eppendorf公司产品。

1.2实验分组采用含体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青链霉素双抗的DEME培养基于体积分数5%CO2的37 ℃恒温培养箱中常规培养MH7A细胞。每2～3 d换新鲜培养液，待细胞铺满瓶底85%时，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，收集生长良好的第3代至5代细胞进行实验。将对数生长期的MH7A细胞以胰蛋白酶消化，制成2.5×105个/mL的细胞悬液后，以每孔100 μL接种至6孔板，常规培养24 h至汇合度达70%左右时，分3组处理。NC-siRNA组和TLR4-siRNA组参照脂质体2000的使用说明书操作，分别转染阴性对照(NC)siRNA和TLR4-siRNA。NC-siRNA正义序列：5’-UUCUC CGAACGUGUCACGUTT-3’，反义序列：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；TLR4-siRNA正义序列：5’-CCACCUCUCUACCUUAAUATT-3’，反义序列：5’-UAUUAAGGUAGAGAGGUGGTT-3’；均由上海吉玛公司合成。空白对照组细胞不转染，只加入含等量脂质体2000的培养液培养。转染6 h后换液，继续培养48 h。

1.3 3组细胞中TLR4mRNA和蛋白的检测①TLR4 mRNA的检测：参照RNA提取试剂盒说明书步骤抽提细胞总RNA，并反转录得cDNA。PCR反应体系包含SYBR®Premix Ex Taq(2×)10 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O7.2 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40次。采集数据，以β-actin作为看家基因，用2-ΔΔCt法计算TLR4 mRNA的相对表达量。TLR4引物F: 5’-TGAG GACCGACACACCAATG-3’，R: 5’-TGCAATGGAT CAAGGACCAG-3’；β-actin引物F: 5’-GCGCGGC TACAGCTTCA-3’，R: 5’-TCTCCTTAATGTCACG CACGAT-3’。引物均由美国Invitrogen公司合成。②TLR4蛋白的检测：采用Western blot法。参照总蛋白提取试剂盒说明书提取细胞总蛋白，BCA法定量后，行SDS-PAGE凝胶电泳分离。电转至PVDF膜后，于50 g/L去脂奶粉-TBST封闭液中室温封闭1 h。加入稀释度为1∶1 000的TLR4和内参β-actin抗体4 ℃结合24 h，再加入稀释度为1∶2 000的辣根过氧化酶标记的二抗室温结合1 h。封闭液洗膜10 min×3次，ECL避光显影曝光。凝胶成像系统采集图片，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.4 3组细胞增殖活性的检测调整对数生长期MH7A细胞的密度为3.5×104个/mL，按照每孔100 μL接种至96孔板上，于培养箱中培养至70%汇合度时按照1.2的方法分3组处理，每组5个复孔。分别于转染48 h和72 h后，加入MTT试剂20 μL于培养箱内培养4 h，加入二甲基亚砜，上多功能酶标仪检测，检测波长450 nm。以吸光度表示增殖活性，实验重复3次。

1.5 3组细胞克隆形成能力的检测转染48 h后，分别收集3组细胞接种于6孔板，每孔4×103个，于细胞培养箱内常规培养14 d。弃培养液，磷酸缓冲液洗涤，多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色30 min。洗去染液，显微镜下选取6个视野，计数细胞数大于20的克隆数，取均值表示克隆计数结果。实验重复3次。

1.6 3组细胞侵袭能力的检测转染48 h后，分别收集3组细胞，胰蛋白酶消化后以去血清培养基制备5×104个/mL的细胞悬液。取100 μL接种于Matrigel包被的Transwell小室上室，下室中加入含血清的完全培养基600 μL，置于培养箱内常规培养48 h，多聚甲醛固定，结晶紫染色。小心擦去小室上层未穿过滤膜的细胞，显微镜下选取6个视野，计数穿膜细胞数，取均值表示最终计数结果。实验重复3次。

1.7 3组细胞中PCNA、MMP-9、VEGF表达的检测采用Western blot法，具体操作同1.3，其中PCNA、MMP-9、VEGF和β-actin抗体稀释度均为1∶1 000。实验重复3次。

1.8统计学处理采用SPSS 22.0进行统计学分析。3组增殖活性、克隆计数、穿膜细胞数、各蛋白表达水平和TLR4 mRNA表达水平的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组细胞中TLR4的表达转染48 h后，3组细胞中TLR4蛋白(图1)和mRNA的表达情况见表1。TLR4-siRNA组细胞中TLR4蛋白和mRNA的表达均低于空白对照组和NC-siRNA组(P<0.05)。

图1 Western blot法检测TLR4 蛋白的表达

组别nTLR4蛋白 TLR4 mRNA空白对照组30.47±0.051.00±0.05NC-siRNA组30.52±0.040.94±0.07TLR4-siRNA组30.14±0.02∗0.26±0.03∗F85.267262.138P<0.001<0.001

*：与空白对照组和NC-siRNA组相比，P<0.05

2.2 3组细胞增殖活性、克隆形成能力和侵袭能力的比较结果见表2。与空白对照组相比，NC-siRNA组增殖活性、克隆形成能力和细胞侵袭能力无明显变化，而TLR4-siRNA组细胞增殖活性、克隆形成能力和细胞侵袭能力均降低(P<0.05)。

表2 3组细胞增殖活性、克隆计数和穿膜细胞数的比较

*：与空白对照组和NC-siRNA组相比，P<0.05

2.3 3组细胞中PCNA、MMP-9和VEGF蛋白的表达见图2和表3。与空白对照组相比，NC-siRNA组PCNA、MMP-9和VEGF蛋白表达无明显变化，而TLR4-siRNA组3种蛋白的表达均降低(P<0.05)。

图2 Westernblot法检测 PCNA、 MMP-9和VEGF蛋白的表达

组别nPCNA MMP-9VEGF空白对照组30.52±0.030.83±0.060.74±0.05NC-siRNA组30.55±0.040.88±0.050.69±0.05TLR4-siRNA组30.26±0.02∗0.41±0.03∗0.13±0.03∗F78.931123.47148.254P<0.001<0.001<0.001

*：与空白对照组和NC-siRNA组相比，P<0.05

3 讨论

TLR4是一种膜结合蛋白，可通过识别并结合病原相关分子的模式与HMGB1结合，激活下游PI3K/AKT、NF-κB和JNK等信号通路，引起免疫炎症、细胞增殖、侵袭和凋亡等一系列反应，与多种疾病的发生发展有关[1-3]。TLR4/MyD88异常高表达能够促进子宫内膜异位症异位细胞的增殖与侵袭[8]；LPS可诱导TLR4信号转导途径激活，促进食管鳞癌细胞增殖，增加促炎或免疫抑制性细胞因子TNF-α、TGF-β的生成并抑制抗炎细胞因子IL-10的产生[9]；而TLR4表达被阻断后，HMGB1诱导的肝星状细胞增殖能力明显受到抑制[10]。RA是一种以滑膜组织炎性增生和浸润为主要病理改变的自身免疫性疾病，而与炎症关系密切的TLR4在RA中发挥着重要作用。miR-146a可通过抑制TLR4/NF-κB途径抑制RA-FLSs的增殖和炎症反应[11]；艾灸干预改善RA大鼠膝关节滑膜组织的病理改变与抑制TLR4/MyD88/NF-κB途径异常激活，缓解炎症性滑膜浸润、滑膜细胞增殖等有关[12]；在南蛇藤素抗RA滑膜细胞侵袭的研究中，TLR4/NF-κB通路活化受阻下调MMP-9转录是重要的调控机制[13]。

我们通过脂质体法将TLR4-siRNA干扰序列转染至人RA滑膜成纤维细胞MH7A，成功下调了细胞内TLR4的表达，同时细胞的增殖活性、克隆形成能力和侵袭能力均受到抑制。结果提示，TLR4在RA滑膜成纤维细胞增殖和侵袭过程中发挥着重要的促进作用。PCNA是与细胞增殖关系密切的核抗原，是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，是一个反映细胞增殖状态的指标[14]。MMP-9是基质金属蛋白酶家族中研究较多的成员，其可通过调节降解和重塑作用维持细胞外基质的动态平衡，参与细胞的侵袭和迁移等过程，还可作为炎症介质参与细胞的炎症反应，与RA炎性细胞浸润关系密切[15]。VEGF是诱导滑膜血管生成的重要因子，可通过调控血管通透性促进细胞转移和物质渗透，在细胞迁移和黏附等过程中发挥重要作用[16]。已有研究[17-19]证实，TLR4的激活可上调淋巴瘤细胞中PCNA的表达，促进癌细胞的增殖；脂多糖以TLR4依赖的方式诱导人动脉平滑肌细胞MMP-9的表达；TLR4也可通过AKT通路诱导鼻息肉组织中VEGF的表达。本研究结果显示，在TLR4低表达的MH7A细胞中3种蛋白的表达水平均明显降低，提示沉默TLR4可通过下调PCNA、MMP-9和VEGF的表达抑制RA滑膜成纤维细胞的增殖和侵袭。

综上所述，TLR4在RA发生和发展过程中发挥着重要作用，沉默TLR4可能通过下调PCNA、MMP-9和VEGF表达抑制滑膜成纤维细胞的增殖和侵袭。这一发现为特异性干预TLR4基因或研制TLR4特异性抑制剂治疗RA提供了理论依据。