SCN5A 基因多态性与糖尿病心脏病变患者左室功能的关系

王可 闫鹏 张恒亮 赵希坤 赵飞龙 王腾飞 董平栓

河南科技大学第一附属医院，心血管内科重症病区（河南洛阳471000）

糖尿病心脏病变是指糖尿病患者因血糖、血脂等代谢紊乱进一步引起的心脏微血管、大血管以及心肌组织、植物神经紊乱等病变，为糖尿病较为常见的并发症之一［1］，其有着较高的致残致死率，研究发现约有70%～80%的糖尿病患者最终死于心血管并发症［2］。SCN5A 基因编码Na+通道的成孔亚单位，在控制心肌细胞的兴奋传导以及兴奋维持方面起着重要作用。研究显示［3⁃4］，SCN5A 基因的一些常见单核苷酸多态位点与心脏疾病（如心脏性猝死、单纯性先天性心脏病、病态窦房结综合征等）有关。目前研究的与心脏病变有关的SCN5A 的多态位点有H55R、P1090L、D1819D、C5457T 等［5］，但目前对于SCN5A 基因多态性与糖尿病心脏病变的关系研究报道相对较少，本研究旨在探讨SCN5A 基因C5457T 位点与糖尿病心脏病变的关系，以期为临床预防和治疗糖尿病心脏病变提供一定的依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2013年4月至2015年4月于我院心内科门诊及住院接受治疗的T2DM 合并心脏病变患者102 例（T2DM+HD 组），其中男60 例，女42 例，糖尿病病程在10～19年，平均（14.69 ±4.22）年，年龄46～71 岁，平均（57.92±8.46）岁，所有研究对象均符合1999年世世界卫生组织（world health organization，WHO）有关糖尿病的诊断标准以及2013年欧洲心脏病学会心脏病变（糖尿病性心脏病包括冠状动脉粥样硬化性心脏病，糖尿病性心肌病、微血管病变和自主神经功能紊乱所致的心律及心功能失常）的诊断标准［6］，采用调整后双腔Simpson 法测得左室射血分数50%以上。排除标准：T1DM，合并有其他糖尿病并发症，如糖尿病肾病、糖尿病足等；临床诊断为继发性高血压、房颤或其他严重心律失常，中到重度瓣膜疾病、先天性心脏病；超声检查显示静息或负荷室壁运动出现异常及图像质量显示不理想；合并有严重的全身其他系统疾病，近期有重大外伤或手术治疗者，出现高热或者慢性感染者；可能影响心脏功能的非心脏疾病，如甲亢、贫血、慢性酒精中毒等。选取同期在我院门诊、内分泌科住院，病程≤1年的单纯T2DM 患者96 例（T2DM 组），其中男54 例，女42 例，年龄49～70 岁，平均（57.29±6.64）岁，单纯T2DM 患者符合美国糖尿病协会（American Dia⁃betes Association，ADA）（2009年）和1999年WHO制定的有关T2DM 诊断标准，需要排除DPN、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病以及糖尿病血管病变患者；另选取同期在我院经体检合格的健康人员60 例作为对照组（NC 组），男36 例，女24 例，年龄43～69 岁，平均（56.77 ± 8.42）岁。3 组对象在年龄、性别方面，差异无统计学意义（P＜0.05），数据具有可比性。3 组研究对象均签订知情同意书，并经医院伦理委员会批准执行。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集 收集所有受试对象年龄、性别、T2DM 病程、心脏疾病病程、体质指数（body mass index，BMI）、血压、心率、吸烟史（近1年内每周吸烟＞10 支）以及饮酒史。受试对象禁食8h，清晨空腹抽取肘静脉血5 mL 用于检测空腹血糖（fast⁃ing plasma glucose，FPG）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL⁃C）、高密度脂蛋白胆固醇（high⁃density lipoprotein cholesterol，HDL⁃C），均采用美国雅培C8000 全自动生化分析仪检测、糖化血红蛋白（HbA1c，ARKRAY HA8160 糖化血红蛋白分析仪检测），超敏C 反应蛋白（hypersensitive C⁃reactive protein，hs⁃CRP，免疫增强比浊法），游离脂肪酸（free fatty acid，FFA，酶比色法）。

1.2.2 左室功能检测 受试对象取仰卧位，保持呼吸通畅，同步记录心电图（仪器为HP5500型彩色多普勒超声诊断仪），探头频率为2.0～4.0 MHz。行常规二维超声及血流多普勒检测，心尖四腔心切面取样容积主要位于二尖瓣瓣尖处，获取二尖瓣血流频谱图，主要测量舒张早期峰值流速（early diastolic peak flow velocity，VE）、舒张晚期峰值流速（late dia⁃stolic peak flow velocity，VA）以及E 峰减速时间（E peak deceleration time，VEDT），计算VE/VA。心尖四腔心以及两腔心采用双腔Simpson法测量左室射血分数（ejection fraction，LVEF）、左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左室收缩末期内径（left ventricular end systolic diam⁃eter，LVESD）、左心室后壁厚度（left ventricular poste⁃rior wall thickness，LVPWT）、室间隔厚度（interven⁃tricularseptal thickness，IVST）、左室心肌重量指数（left ventricular mass index，LVMI）。

1.2.3 PCR⁃RFLP 技术检测SCN5A 基因C5457T位点多态性 空腹抽取受试对象肘静脉血样标本5 mL 置于含有EDTA 的EP 管中，采用传统的酚⁃氯仿法提取样本中DNA，保存于-80 ℃冰箱中备用，采用PCR⁃RFLP 技术检测SCN5A 基因C5457T 位点多态性。引物以及探针经Primer Express 2.0 软件进行设计，并经上海生工生物科技有限公司合成。上游引物序列：5′⁃ CGCGTACGATCGCTGGC⁃TAGC ⁃3′，下游引物序列：5′⁃ GGCGATCGACTA⁃AGTACGCTACTAC⁃3′，。PCR 扩增体系为25 μL，其中含有5 μL PCR 缓冲液，上游及下游引物各0.5 μL，5 U/L Taq DNA 聚合酶0.25 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4.0 μL，剩余加入双蒸水。SCN5A 基因C5457T 位点的扩增反应条件为：94 ℃预变性2 min，而后按照94 ℃30 s、59 ℃30 s、62 ℃15 s 的顺序进行40 个循环，最后以62 ℃延伸1 min。PCR扩增产物长度为310 bp。所有样本均在ABI⁃7500 fast RT⁃PCR 电泳仪上进行反应，抽取10%的样本进行基因测序，从而确定基因分型检测的准确性。

1.3 随访 所有糖尿病心脏病变患者均接受随访，随访截止时间为2018年5月1日，随访中位时间为13 个月，随访最长时间3年1 个月，随访方式为门诊随诊、电话咨询等方式，随访以患者出现心血管事件（指心源性死亡及因心脏相关疾病再次入院）或到随访截止时间为终点。

1.4 统计学方法 所得数据中符合正态分布的计量资料以表示，两组间采用两个独立样本的t检验，3组基因型间采用单因素方差分析，组内比较采用LSD⁃t检验，非正态分布资料以中位数（四分位距）表示，采用秩和检验，计数资料以百分率表示，采用R×C χ2检验或Fisher 精确检验。群体基因型采用Hardy⁃Weinberg平衡检验。采用非条件的Logistic回归分析检测SCN5A基因C5457T位点与糖尿病心脏病变的遗传效应之间的关系，并经多重检验P值的Bonferroni 对年龄、性别等干扰因素进行校正，采用Kaplan⁃Meier法进行生存分析，累积危险曲线比较采用Log Rank检验，所获取数据均经SPSS 19.0统计软件包分析处理，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SCN5A 基 因C5457T 位 点 的PCR 产 物SCN5A 基因C5457T 位点酶切中呈现一条亮的且长度为310 bp 的条带为TT 型；出现123 bp、177 bp、310 bp 三条亮带的为CT 型，出现在123 bp、177 bp 两条带为CC 型。随机选取SCN5A 基因C5457T 的PCR 扩增产物行基因测序，结果显示碱基的改变与酶切结果一致（图1）。

图1 SCN5A 基因C5457T 位点的PCR 扩增及电泳图Fig.1 PCR amplification and electrophoresis map of C5457T site in SCN5A gene

2.2 一般临床资料结果比较 研究显示，T2DM +HD 组、T2DM 组BMI、FPG、HbA1c、TG、HDL⁃C、hs⁃CRP、FFA，与NC 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。T2DM+HD组高血压史、HbA1c、TG、LDL⁃C、HDL⁃C、hs⁃CRP、FFA、VE/VA、IVST、LVMI、LVEF、LVEDD，与T2DM 组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组受试者一般临床资料结果比较Tab.1 Comparison of general clinical data between groups ±s

表1 各组受试者一般临床资料结果比较Tab.1 Comparison of general clinical data between groups ±s

注：与NC 组比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与T2DM 组比较，△P＜0.05，☆P＜0.01

组别NC 组T2DM 组T2DM+HD 组F 值P 值HbA1c（%）5.01±0.48 6.82±0.86*8.96±0.94#△9.866 0.004 TC（mmol/L）4.39±0.67 4.69±0.73 4.77±0.75 0.297 0.786 TG（mmol/L）1.46±0.27 2.98±0.34*4.86±0.72#☆11.997 0.030 LDL⁃C（mmol/L）2.19±0.59 2.79±0.63 3.37±0.81*△7.224 0.018 HDL⁃C（mmol/L）1.52±0.29 1.14±0.21*0.83±0.19#△7.521 0.017 hs⁃CRP（mg/L）2.64±0.51 5.96±0.64#8.99±0.76#☆13.515 0.000 FFA（mmol/L）0.73±0.24 1.36±0.29*1.88±0.42#△11.952 0.000组别NC T2DM T2DM+HD F/χ2值P 值性别（男/女）36/24 54/42 60/42 0.134 0.714年龄（岁）56.77±8.42 57.29±6.64 57.92±8.46 0.366 0.628 BMI（kg/m2）23.74±2.69 25.94±2.51*25.97±3.03*5.032 0.043高血压病史［例（%）］12（20.00）25（26.04）50（49.02）#☆11.097 0.003吸烟史［例（%）］37（61.67）59（61.46）65（63.73）0.109 0.742 FPG（mmol/L）5.27±0.61 8.26±0.91#8.64±1.03#8.997 0.010组别NC T2DM T2DM+HD F 值P 值VE/VA 0.74±0.08 0.79±0.010 0.51±0.08*△5.435 0.039 IVST（mm）11.12±1.14 12.09±1.21 18.06±1.38*△10.262 0.001 LVMI（g/m2）132.54±29.81 136.94±30.54 178.33±34.63*△9.882 0.004 LVEF（%）64.51±4.47 61.94±5.22 51.68±6.84*△6.881 0.024 LVEDD（mm）50.26±4.27 49.87±4.31 42.58±4.72*△6.822 0.026 LVESD（mm）38.64±5.74 39.84±5.44 40.21±6.10 1.101 0.147 LVPWT（mm）12.49±0.80 11.98±0.91 11.68±0.97 1.921 0.122

2.3 SCN5A 基因C5457T 位点基因型分布 研究显示，3 组研究对象SCN5A 基因C5457T 位点基因型及C、T 等位基因频率符合Hardy⁃Weinberg 遗传平衡定律，说明符合群体代表性。T2DM + HD 组TT基因型、T等位基因频率高于NC组、T2DM组，差异有统计学意义（χ2=20.678、23.135、9.677、10.747，P＜0.01）；T2DM组T等位基因频率与NC组差异有统计学意义（χ2=4.468，P＜0.05），见表2。

表2 SCN5A 基因C5457T 位点基因型分布情况比较Tab.2 Comparison of genotype distribution of C5457T loci in SCN5A gene 例（%）

2.4 糖尿病心脏病变的回归分析 以T2DM+HD作为因变量（是为1，否为0），以T2DM + HD 组与NC 组之间差异有统计学意义的指标作为自变量行Logistic回归分析，高血压史、HbA1c、TG、HDL⁃C、hs⁃CRP、FFA、IVST、LVMI 为T2DM + HD 的影响因素（表3）。

表3 糖尿病心脏病变的Logistic 回归分析Tab.3 Logistic regression analysis of diabetic heart disease

2.5 不同基因型临床生化指标表达结果 研究显示，TT 型患者TG、LDL⁃C、HbA1c、hs⁃CRP、FFA、IVST、LVMI，与CC型、CT型比较差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），CT 型患者hs⁃CRP、FFA，与CC型比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

2.6 糖尿病心脏病变不同基因型患者随访分析 通过随访研究发现，TT型患者出现心血管事件累积发生风险与CC型、CT型患者比较，差异有统计学意义（Log χ2=5.586、4.763，P=0.015、0.027），见图2。

3 讨论

糖尿病心脏病变是T2DM 较为常见的心血管并发症之一，与心肌代谢紊乱、心肌细胞纤维化、微血管内皮功能损伤以及自主神经病变等有密切关系，临床表现可从无症状发展至严重的心律不齐、急性心肌梗死、心力衰竭乃至心源性死亡等［7］。目前，有研究认为导致糖尿病心脏病变的危险因素主要包括高龄、女性、遗传因素、血糖、血脂代谢紊乱、高血压、高胰岛素血症等［8］。为了进一步阐明影响糖尿病心脏病变的危险因素，我们将纳入的102 例糖尿病心脏病变患者行Logistic 回归分析，结果显示，高血压史、HbA1c、TG、HDL⁃C、hs⁃CRP 等均为糖尿病心脏病变的危险因素，提示高血压、血糖控制水平、血脂异常以及炎症反应均有可能导致糖尿病心脏病变的发生。

人类SCN5A 基因为电压门控Na+通道基因家族中的一员，位于染色体3P21，编码电压门控性Na+通道基因，含有4 组同源结构域，含有28 个外显子［9］。研究发现［10⁃11］，SCN5A 基因变异不仅能够导致心律失常性疾病，如长QT 综合征、特发性室颤以及心脏传导阻滞等相关疾病，而且SCN5A 基因不同位点单核苷酸多态性与心脏Na+通道疾病有关。目前研究的与心脏病变有关的SCN5A 的多态位点有H55R、P1090L、D1819D、C5457T 等，但目前对于SCN5A 基因多态性与糖尿病心脏病变的关系研究报道相对较少，通过本研究发现，SCN5A 基因C5457T 位点存在基因分型、等位基因频率分布差异，糖尿病心脏病变患者TT 型、T 等位基因频率显著高于单纯T2DM 患者、NC 组人员，提示该基因位点可能为糖尿病心脏病变的易感基因。为了分析探讨糖尿病心脏病变患者不同基因分型之间是否存在临床生化指标表达差异，本研究进一步统计发现TT 型 患 者TG、LDL⁃C、HbA1c、hs⁃CRP、FFA、IVST、LVMI高于CC型、CT型患者，表明SCN5A 基因C5457T 位点不同基因分型之间存在临床生化指标表达及左室功能异常差异。值得注意的是，目前对于糖尿病心脏病变远期心血管事件的研究分析较少。本研究发现，TT 型患者远期发生心血管事件的累积危险发生率明显高于CC型，笔者认为可能与TT 型患者血脂、心室功能异常程度更高存在因果关系。同时，早期的研究［10］已证实SCN 5A 基因的变异与多种严重心律失常关系密切，而CC 基因型为保护型，但CC 型是否单纯通过改善血脂、心功能和心律失常发挥心血管保护作用，有待进一步探索。

表4 不同基因型临床生化指标表达结果Tab.4 Expression of clinical and biochemical indexes of different genotypes ±s

表4 不同基因型临床生化指标表达结果Tab.4 Expression of clinical and biochemical indexes of different genotypes ±s

注：与CC 基因型比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与CT 基因型比较，△P＜0.05

基因型Genotypes CC CT TT F 值P 值VE/VA 0.53±0.09 0.53±0.010 0.50±0.08 0.435 0.639 IVST（mm）15.68±0.94 16.36±0.61 19.27±0.57*△8.262 0.018 LVMI（g/m2）159.94±21.97 167.52±20.69 192.33±22.49*△9.882 0.004 LVEF（%）54.47±3.28 52.63±3.22 49.79±3.17 1.881 0.133 LVEDD（mm）43.41±3.74 42.19±3.39 41.63±3.42 2.042 0.102 LVESD（mm）39.86±6.14 39.42±6.63 41.83±5.97 1.101 0.147 LVPWT（mm）11.99±0.92 11.03±0.96 10.97±0.92 1.921 0.122基因型CC CT TT F 值P 值TG（mmol/L）3.69±0.96 3.82±0.98 5.13±0.89#△11.443 0.000 TC（mmol/L）4.66±0.86 4.74±0.92 4.91±0.90 1.098 0.104 LDL⁃C（mmol/L）2.88±0.65 3.03±0.41 3.52±0.43*△8.993 0.017 HDL⁃C（mmol/L）0.87±0.19 0.82±0.14 0.80±0.13 0.232 0.781 HbA1c（%）8.13±0.67 8.62±0.74 9.61±0.61*△8.138 0.019 FPG（mmol/L）8.53±0.61 8.62±0.64 9.16±0.67 1.288 0.142 hs⁃CRP（mg/L）6.34±0.51 8.44±0.61*9.32±0.53#△23.524 0.000 FFA（mmol/L）1.14±0.51 1.51±0.49*1.96±0.50#△17.824 0.000

图2 Kalplan⁃Meier 法分析不同基因型患者心血管事件累积危险曲线Fig.2 Cumulative risk curves Kalplan⁃Meier analysis of cardiovascular events in patients with different genotypes

需要指出的是，目前研究证实无明显心脏病变的无症状糖尿病患者可能已经存在左心室功能异常［12］，因此及时对糖尿病患者进行生活方式调整和药物干预有助于减少糖尿病心衰的发生。临床有研究显示［13］，早期心脏功能受累的糖尿病患者均存在早期舒张、收缩功能异常。目前普遍认为糖尿病心脏变与代谢异常、心肌纤维化、心肌细胞肥大等有一定关系［14］。本研究显示，糖尿病心脏病变组VE/VA、IVST、LVMI、LVEF、LVEDD，与T2DM 组、NC 组比较差异有统计学意义，采用Lo⁃gistic 回归分析显示，IVST、LVMI 为糖尿病心脏病变的影响因素。长期的全身小动脉血管腔狭窄是导致周围血管阻力升高进而引起左心室肥厚的重要原因，而左心室肥厚能引发心血管疾病的发生发展，研究显示血脂异常与IVST、LVMI 等指标相关［15］，血脂代谢异常也是导致左心室肥厚的重要影响因素之一。因此，笔者认为糖尿病患者血脂代谢异常引起全身小动脉血管狭窄、导致糖尿病患者左心室肥厚，进而引起糖尿病心脏病变。但需要指出的是，血脂代谢是如何导致糖尿病患者左心室功能变化有待进一步研究。通过基因多态性分析也显示，TT 基因型TG、LDL⁃C、FFA 等血脂指标以及IVST、LVMI 等左心室功能指标与CT、CC型比较差异有统计学意义，这在一定程度上说明不同基因型血脂代谢不尽相同，这对于课题组后续进一步研究糖尿病心脏病变以及药物干预有一定的研究意义。

综上，SCN5A 基因多态性为糖尿病心脏病变患者左室功能障碍易感基因，其可能与血脂代谢异常相关。