黑升麻提取物对人肝癌细胞系HepG2增殖和凋亡的影响

倪 璠，柯 阳，邹仁超，艾润垚，马瑞成，周 剑，郭志唐，王 琳※

(1.昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科，昆明 650101； 2.昆明医科大学，昆明 650500)

肝细胞癌是全球癌症发病率排名第六位，癌症致死人数排名第四位的恶性肿瘤[1]。目前早期肝细胞癌的治疗主要以外科手术切除为首选[2]，但术后复发率高，预后较差。因此，探索抑制肝细胞癌发生发展的分子机制，寻找更有效安全治疗药物是当务之急。黑升麻为毛茛科植物，广泛生长于欧洲、北美及亚洲。其传统药用部分为根及茎，其中主要成分为两大类化合物三萜糖苷和苯丙素类。美国原住民一直将其用作解热镇痛、抗炎剂[3]。1820年被载入《美国药典》，黑升麻用于治疗围绝经期综合征已有100多年历史，而相关研究普遍认为其体内作用机制异于雌激素[4-5]。大量实验表明黑升麻提取物不仅不会增加患乳腺癌的风险[6]，反而对乳腺癌细胞生长具有抑制作用[7-11]。而在体外实验中，给予Spragne-Dawley雌性小鼠口服高浓度黑升麻提取物可有效降低小鼠乳腺癌的发生率[12]。近年来研究发现，三萜糖苷中的Actein对胶质瘤、胃癌、膀胱癌、前列腺癌等肿瘤细胞生长同样具有抑制作用[13-17]。本研究拟探讨黑升麻提取物对人肝癌细胞系HepG2增殖和凋亡的影响，期待发现新的抗肝细胞癌药物。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验药物和细胞株 黑升麻提取物(三萜皂苷含量8%)S27368-100 g购自上海源叶生物科技有限公司。HepG2(人肝癌细胞)购自昆明动物所。

1.1.2主要试剂及仪器 DMEM/F12(dulbecco′s modified eagle medium/F12)基础培养基、胎牛血清、1%青链霉素双抗、谷氨酰胺、细胞计数试剂盒8(cell counting Kit-8，CCK-8)、Annexin V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-fluoresceine isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒购自上海东仁化学公司；RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液，二辛可宁酸蛋白浓度测定试剂盒，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液(5X)购自中国碧云天公司。增强型化学发光液显色液购于美国Millipore公司，丽春红染色液、牛血清白蛋白购于北京索莱宝公司。内参一抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)购自中国Abmart公司。检测二抗辣根过氧化物酶标记通用型二抗购于美国CST公司。丙烯酰胺、SDS、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、四甲基乙二胺均购于美国Sigma/Amresco公司。蛋白酶抑制剂Phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF)、磷酸化蛋白酶抑制剂购自瑞士Roche公司。仪器：恒温干燥箱(日本SANYO公司)，自动消毒锅(日本SANYO公司)，-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo公司)，掌上离心机(中国白鸽公司)，低温离心机HITACH(日本CF-16RX公司)，全波长分光光度计(上海UNICO公司)，酶标仪(美国Thermo公司)，凝胶成像仪、垂直电泳槽、湿式转膜槽(美国BIO-RAD公司)，封口机(中国上海麦尔多公司)，静音混合仪(中国其林贝尔公司)，Whatman滤纸(3 mm)(美国GE公司)，高速冷冻离心机(美国Thermo scientific公司)，流式细胞仪(德国Parc Gmbh，CyFlow Space公司)，CO2培养箱(中国力康生物公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 HepG2细胞用DMEM/F12+10%胎牛血清+1%双抗+1%谷氨酰胺，37 ℃、5% CO2条件下培养，每两天传代一次，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2黑升麻提取物对HepG2细胞增殖的影响 黑升麻提取物用二甲基亚砜配制成50 mg/mL的储存液，4 ℃冰箱避光保存。接种HepG2细胞至96孔板内，每孔接种5 000个细胞，按以下实验条件分组并更换培养基：空白孔(加含30 μg/mL黑升麻提取物的DMEM/F12基础培养基，未接种细胞)、黑升麻药物浓度0、10、20、30、40、50 μg/mL组的DMEM/F12基础培养基，每组3个孔重复，每孔液体量为100 μL。细胞培养箱内培养48 h(5% CO2，37 ℃)，每个孔加入10 μL的CCK-8试剂，CO2培养箱内孵育2 h，酶标仪450 nm波长下检测吸光度，收集数据，计算细胞抑制率。细胞存活率=(实验组-空白孔)/(对照组-空白孔)×100%。

1.2.3流式细胞术检测黑升麻提取物对HepG2细胞凋亡的影响 接种HepG2细胞至6孔板内，每孔接种105个细胞，当细胞融合度达到70%时，将HepG2细胞培养基更换为含黑升麻0、10、20、32 μg/mL的DMEM/F12基础培养基。磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞2次，0.25%胰蛋白酶消化细胞，完全培养基终止消化。以离心半径8 cm，1 000 r/min离心3 min，弃上清。加入磷酸缓冲盐溶液后1 000 r/min离心3 min，弃上清(重复该步骤两遍)。加入200 μL Annexin V Binding Buffer，重悬细胞，随机取100 μL细胞悬液，加入新的1.5 mL离心管中，向细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC结合物，5 μL的碘化丙啶。室温下避光染色15 min，每管加入900 μL磷酸缓冲盐溶液，加样到流式细胞仪检测。

1.2.4Western blot检测Cleaved caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表达 向黑升麻0、10、20、32 μg/mL组细胞6孔板中分别加入100 μL的RIPA裂解液(含1 μL蛋白酶抑制剂)，冰浴上裂解15 min，细胞刮刀刮取细胞收集到1.5 mL离心管中，低温高速离心机中离心(4 ℃，12 000 r/min,离心半径10 cm)加入100 μL SDS上样缓冲液，93 ℃水浴10 min，-20 ℃保存备用。根据二辛可宁酸试剂盒说明书操作测定蛋白浓度，调整各个样品的蛋白上样量为80 μg进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜膜上，将聚偏二氟乙烯膜膜置于5%的牛血清白蛋白中，室温(20～30 ℃)封闭1.5 h，脱色，吸干牛血清白蛋白液，加入一抗2 mL，4 ℃冰箱中过夜。去除一抗后TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。加入酶标二抗，室温孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。增强化学发光显色液显色处理后，暗室中曝光。

2 结 果

2.1黑升麻提取物抑制HepG2细胞增殖 各组抑制率比较差异有统计意义(F=139.300,P<0.05),随着各组给药浓度的增加抑制率逐渐升高(P<0.05)，存活率逐渐降低。黑升麻IC50为32.010 μg/mL。见表1。

组 别实验孔OD值抑制率(%)存活率(%)0 μg/mL组3.16±0.09010010 μg/mL组1.29±0.0212.51±9.31a87.49±9.3120 μg/mL组1.09±0.0727.85±1.51ab72.15±1.5130 μg/mL组0.75±0.0553.20±5.55abc46.80±5.5540 μg/mL组0.57±0.0367.42±3.54abcd32.58±3.5450 μg/mL组0.38±0.0181.43±0.73abcde18.57±0.73

a与0 μg/mL组比较，P<0.05；b与10 μg/mL组比较，P<0.05；c与20 μg/mL组比较，P<0.05；d与30 μg/mL组比较，P<0.05；e与40 μg/mL组比较，P<0.05

2.2黑升麻提取物促进HepG2细胞凋亡 各组细胞经Annexin-V-FIFC/PI双染后，与0 μg/mL组相比，10 μg/mL组、20 μg/mL组、32 μg/mL组早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞所占百分比明显增加，且随着黑升麻提取物给药浓度的增加，凋亡细胞所占百分比明显增加，见图1A、1B、1C、1D。HepG2细胞系中，黑升麻提取物10、20、32 μg/mL给药浓度处理后凋亡细胞百分比与0 μg/mL组对比显著增高(P<0.05),见图1E。

2.3黑升麻提取物促进HepG2细胞Cleaved caspase-3、8、9蛋白表达 HepG2细胞中，与0 μg/mL组比较，20、32 μg/mL组Cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)；与0 μg/mL组比较，32 μg/mL组Cleaved caspase-8蛋白表达升高(P<0.05)；HepG2细胞中，不同药物浓度处理后Cleaved capase-9蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

3 讨 论

黑升麻根茎被德国E委员会批准为治疗经前期综合征和绝经综合征的自主神经症状的非处方药，含其主要成分的产品临床研究已被美国草药典收录，相应的市售药品名为莉芙敏片[18]。相较于更年期综合征的传统激素疗法，尚未见黑升麻相关药品有增加乳腺癌、心血管疾病、卒中风险的相关报道，而目前认为其相应作用机制主要与选择性雌激素受体调节、5-羟色胺通路调节机制，抗氧化作用、炎症反应等相关[4]。现普遍认为黑升麻作用机制异于雌、孕、雄激素，亦不同于植物激素。有实验支持黑升麻在癌症患者中的应用是安全的，对于乳腺癌、前列腺癌等激素依赖性肿瘤细胞具有抗增殖作用[19]。因此，基于已有实验结果，为探求新的抗肿瘤药物，本研究主要探究黑升麻对肝癌细胞HepG2凋亡的影响及可能的作用机制。

1A：10 μg/mL组；1B、1C、1D分别为10、20、32 μg/mL浓度的黑升麻提取物处理48 h后人肝癌细胞HepG2细胞凋亡比率；1E:流式细胞实验凋亡细胞数据分析；*与0 μg/mL组比较，P<0.05；#与10 μg/mL组比较，P<0.05；△与20 μg/mL组比较，P<0.05

图1黑升麻提取物处理HepG2细胞48h后凋亡检测

2A：Western blot凝胶图像(Cleaved caspase-3蛋白检测过程出现两条印迹是caspase-3活化时被剪切成19 000和17 000的两个小蛋白，取19 000条带检测灰度值)； 2B、2C、2D分别为Cleaved caspase-3、8、9在HepG2细胞中的表达情况及分析[GAPDH(abmart m20006)为内参，Image J灰度扫描，计算各组相对灰度值]；*与0 μg/mL组比较，P<0.05

图2黑升麻提取物促进HepG2细胞Cleavedcaspase-3、8、9蛋白表达

肿瘤细胞是通过在细胞内外过度表达抗凋亡因子，使平衡朝向自身生存，对细胞凋亡抵抗，从而导致肿瘤生长控制的丧失[20]。本实验发现黑升麻可以抑制HepG2增殖，促进HepG2凋亡。有研究显示，黑升麻单体Actein可以抑制在胶质瘤U87细胞和U251细胞集落形成，增加促凋亡因子Bax、caspase-3和caspase-9片段以及多聚合酶1的表达，减少抗凋亡基因Bcl-2的表达，从而抑制肿瘤生长，其相关的生物学活性基础可能是触发线粒体介导的细胞凋亡通路[13]。在胃癌SNU-216、AGS细胞系体外实验和异种移植至小鼠体内实验中，Actein可以联合肿瘤坏死相关凋亡诱导酶，并增强对该酶不敏感的胃癌细胞对肿瘤坏死相关凋亡诱导酶的敏感性，从而上调p53中诱导受体1和2，下调抗凋亡基因Bcl-2家族中的Bcl-2、Mcl-1的表达从而诱导线粒体凋亡[14]。膀胱癌BIU-87、T24、T739、5637细胞系的体外实验发现Actein可以诱导癌细胞在细胞周期G2/M生长停滞，伴随自噬小体形成，自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3B-Ⅱ集聚，caspase-3、caspase-8、caspase-9均被活化切割，研究者认为相关机制可能是Actein抑制蛋白激酶B和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，激活c-Jun氨基端激酶磷酸化引起肿瘤细胞凋亡自噬[15]。在给予二乙基亚硝胺诱导产生早期肝癌的C45B2/6小鼠静脉注射Actein，发现其可有效缓解肝脏组织纤维变性，减轻炎症反应，逆转肝损伤，下调血清中甲胎蛋白的表达，相关机制可能是抑制Hedgehog信号通路，促进p53信号通路作用[16]。而黑升麻的单体BN0-1055已被证明在前列腺癌细胞系LNCaP、PC3、DU145中，BNO-1055可以通过抑制补救合成途径对细胞外核苷的吸收从而抗肿瘤细胞增殖，而该部分作用被认为主要与BNO-1055削弱了核苷平衡转移蛋白依赖转移体作用相关[17]。但目前对于黑升麻及其单体促进肿瘤细胞凋亡的作用机制尚未完全阐明。

本研究进一步发现黑升麻促进HepG2细胞caspase-8、caspase-3蛋白酶原激活切割，但未促进caspase-9片段形成。caspase-8是死亡受体通路下游的启动凋亡程序酶[21]，当肿瘤坏死因子R1、Fas、死亡受体4/5等死亡受体与相应受体结合形成死亡诱导信号复合体时，细胞凋亡的外在途径就会被激活[22]。caspase-3是由CASP3基因编码的，外部死亡受体途径和内在线粒体途径启动后共同的效应酶，在凋亡肝癌细胞中明显表达[23]。而caspase-9由CASP9基因编码的凋亡启动蛋白酶，通过磷酸化进行调控激活，引发线粒体内部活化凋亡途径。诱导细胞凋亡是癌症治疗中细胞死亡的首选模式[24]，是癌症治疗关键。因此,进一步明确黑升麻提取物是否引起死亡受体通路上游受体的过表达及具体相应的信号通路将成为后续研究重点。其次，黑升麻提取物对正常肝细胞毒性也需要进一步实验。

综上所述，黑升麻提取物能够抑制肝癌HepG2细胞增殖，促进凋亡，其机制可能与caspase-8介导的外源性死亡受体途径相关。黑升麻具有潜在的抗癌作用，但具体机制需进一步研究。