自噬与凋亡在骨肉瘤中的作用

梁仁政,吉光荣

(哈尔滨医科大学附属第二医院骨七科，哈尔滨 150001)

自噬是一种细胞保护机制，可以降解细胞内受损的细胞器、蛋白质等，从而维持细胞的稳态。然而过度的自噬也可引起细胞质和细胞器等的过度降解，导致细胞死亡。自噬与凋亡是细胞程序性死亡的两种方式，两者在发生过程中存在交叉，对于通过自噬无法处理的细胞，最终可能会诱导细胞凋亡。骨肉瘤是一种常见的，严重威胁儿童和青少年健康的恶性骨肿瘤[1]，来源于骨骼系统的结缔组织，尤其好发于多发性骨髓瘤患者。70%的骨肉瘤患者的发病年龄为10～25岁，临床表现为疼痛和肿胀[2]，如延误诊断，会因肿瘤压迫导致皮肤表面紧缩以及浅表静脉曲张。骨肉瘤开放性活检手术后常发生病理性骨折[3]。骨肉瘤可发生在任何骨骼，以长骨干垢端多见，膝关节最常受累，发生于膝关节的骨肉瘤占所有骨肉瘤的50%[4]。骨肉瘤具有浸润性和远隔转移性，易发生血行转移，最常转移至肺。骨肉瘤恶性程度高且预后差，2年存活率仅为15%～20%[5]。大部分高分化骨肉瘤患者在手术治疗前通常辅以顺铂、阿霉素以及甲氨蝶呤等化疗3个月。近年来，随着大剂量联合化疗的应用，无转移的骨肉瘤患者5年生存率可达55%～70%，但发生转移者5年生存率仅为5%～20%[6-7]。虽然辅助化疗显著提高了骨肉瘤患者的生存率，但仍有一些问题存在，如严重不良反应、复发、转移性并发症等，而化疗耐药是目前骨肉瘤治疗的难点之一。现就自噬与凋亡对骨肉瘤发生以及治疗的作用予以阐述。

1 细胞凋亡的相关分子机制

对于骨肉瘤的治疗，最重要的是诱导肿瘤细胞凋亡、抑制骨肉瘤生长。近年来随着新药物的应用，患者的预后虽然有所改善，但化疗耐药仍普遍存在，成为骨肉瘤治疗的难点[8]。凋亡信号的识别与促细胞凋亡药物的研发为骨肉瘤的治疗提出了新的策略[9]。

1.1凋亡信号通路 细胞凋亡是为维持内环境稳定，由基因调控的细胞自主的有序的死亡。迄今为止，已经发现14种凋亡相关蛋白，主要包括凋亡启动因子、凋亡效应因子以及炎症因子。凋亡信号通路包括外源性凋亡途径和内源性凋亡途径。外源性凋亡途径是由死亡配体与死亡受体结合引发。死亡受体属于肿瘤坏死因子受体超家族，包括肿瘤坏死因子受体1、Fas、重组人死亡受体3、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体2、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体1、死亡受体6、异位受体蛋白A以及神经生长因子，其诱导死亡信号复合体组装，包括Fas相关死亡域蛋白(Fas-associating protein with a novel death domain，FADD)和启动子蛋白胱天蛋白酶(caspase)-8/10。在复合物中，FADD与caspase-8/10相互作用介导FADD蛋白的水解和caspase-8/10的激活，激活的caspase-8/10裂解并激活效应蛋白(caspase-3、6、7)，随后靶向裂解一系列细胞底物，导致细胞凋亡。

内源性凋亡途径是由多种细胞内刺激因素诱导的[10]。在这条通路上，线粒体膜溶解导致促凋亡蛋白从线粒体膜间隙进入细胞质，这个过程依赖于凋亡小体。凋亡小体包括细胞凋亡蛋白酶原9、凋亡蛋白酶活化因子1以及细胞色素C，其可导致caspase-9的聚集和活化，活化的caspase-9切割并激活下游的效应凋亡蛋白酶(caspase-3、6、7)，导致细胞死亡。外源性和内源性凋亡通路存在共同点，在扩大凋亡级联反应中发挥着积极作用。

1.2微RNA(micorRNA，miRNA)调节骨肉瘤细胞凋亡 p53、p21、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)1、结构性转录因子2、第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)、蛋白激酶B等在凋亡通路中发挥着重要作用。有研究提出，miRNA通过调控制骨肉瘤细胞中与化学耐药相关的因子，参与调节细胞凋亡[11]。miR-140的异常过度表达，增加了p53和p21蛋白的表达，提高了骨肉瘤对甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶的敏感性[12]。此外，miR-199a和miR-34a通过p53信号通路诱导人骨肉瘤细胞凋亡[13]。而miR-26a可靶向作用于IGF-1，抑制IGF-1在骨肉瘤中的表达，从而抑制肿瘤[14]。在骨肉瘤中，通过减少BCL2L2、MCL-1、IGF受体、MET等的表达，增加磷酸化蛋白激酶B和局部黏着斑激酶的表达也可起到抑制肿瘤的作用[15]。在人类骨肉瘤细胞中，miR-23a靶向调节PTEN的3′-非翻译区，并负相调节PTEN的表达，通过激活蛋白激酶B/细胞外信号调节蛋白激酶通路，促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭[16]。

1.3骨肉瘤中调节细胞凋亡的化合物 多柔比星和星形孢菌素可靶向诱导骨肉瘤U2OS细胞系中caspase-3和7的活化，并促进细胞凋亡[17]。开瑞坦可通过上调caspase-3和cspase-9的表达，增加caspase-3的裂解水平，抑制人骨肉瘤细胞在体外的增殖[18]。黄芩素可通过线粒体途径诱导骨肉瘤细胞凋亡，又可通过上调热激蛋白70的表达，部分阻止人骨肉瘤细胞的凋亡，并降低骨肉瘤对黄芩素的敏感性[19]。环糊精角叉菜碱、IGF-I受体酪氨酸激酶抑制剂可通过聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1及其裂解产物，抑制多重耐药的骨肉瘤细胞增殖，并促进骨肉瘤细胞凋亡。环氧霉素(蛋白酶抑制剂)能显著提高caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性以及Bax蛋白的水平，诱导骨肉瘤细胞凋亡[20]。

1.4骨肉瘤中调节细胞凋亡的蛋白因子 抑癌蛋白M属于白细胞介素6家族，通过激活信号转导及转录激活因子、p53以及核转移，增加Bax/Bcl-2的比值，最终导致成骨细胞凋亡[21]。Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)家族的转录因子具有调节细胞生长和分化的作用，Runx2可直接靶向作用于Bax，是骨肉瘤细胞的促凋亡因子。此外，Runx2的丢失促进了骨肉瘤对化疗诱导细胞凋亡的敏感性[22]。FOXO转录因子，特别是FOXO1，在骨肉瘤细胞中通过Wnt/β联蛋白途径，起抑制肿瘤细胞的作用[23]。放线菌素D是一种广为人知的转录抑制剂，通过增加裂解的caspase-3和放线菌素D的水平和治疗时间，抑制骨肉瘤细胞的增殖，促进其凋亡[24]。EZH2是聚合酶抑制剂2的催化亚基，敲除EZH2可导致抗凋亡的Bcl-2降低，增加促凋亡的Bax、Bak以及细胞色素C在细胞质的表达，表明EZH2通过内源性凋亡途径抑制细胞凋亡[25]。另外，EZH2也可通过负性调控两种促细胞凋亡的miR-205和miR-31，抑制细胞凋亡[26]。

2 自噬的相关分子机制

至今，自噬对骨肉瘤化疗敏感性和化疗耐药的作用尚未明确。在骨肉瘤治疗过程中，自噬既可以提高化学敏感性，也可以提高化学耐药性。

2.1自噬的信号通路 自噬是一个高度保守的程序，营养物质缺乏、生长因子、激素、细胞内能量信息以及细胞应激如缺氧、病毒感染等均可触发。目前为止，共发现30多个自噬相关基因(autophagy associated gene,Atg)[27]。一些分子复合物在自噬过程中是必不可少的，根据其在自噬过程中的功能分为Atg1蛋白激酶复合物、Ⅲ类磷脂酰肌醇-3-激酶、Beclin1、Atg12共轭系统、Atg8共轭系统以及Atg9。Atg1蛋白激酶复合物是诱导自噬所必需的；Ⅲ类磷脂酰肌醇-3-激酶-Beclin1复合物是囊泡融合所必需的；Atg12-Atg5共轭结构对于囊泡的延展是必要的。

2.2自噬与骨肉瘤的治疗

2.2.1自噬提高化疗的敏感性 类黄酮黄体素通过上调beclin1的表达，促进阿霉素诱导的人类骨肉瘤U2OS细胞自噬，产生细胞毒性，导致U2OS细胞死亡[28]。雄烯二酮衍生物在化疗药物的作用下，通过降低高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)的水平，提高化学敏感性，克服骨肉瘤耐药性[29]。双吲哚生物碱沃卡胺是一种自噬诱导剂，对野生型和多重耐药的肿瘤细胞具有细胞毒性作用，其通过增加微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)的表达和转化促进细胞凋亡[30]。2-甲氧基雌二醇在自噬相关蛋白7(autophagy-related protein 7，ATG7)表达的条件下，通过诱导LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ，促进人类骨肉瘤细胞自噬体形成[31]。此外，自噬可能在抗2-甲氧基雌二醇介导的骨肉瘤中起重要作用。

2.2.2自噬与骨肉瘤的化学耐药性 在骨肉瘤细胞中，HMGB1的水平是升高的，其介导的自噬也会促进化疗耐药[32]。miR-22在化疗期间可代偿性增多，过度表达的miR-22靶向作用于HMGB1，从而抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移，并抑制其介导的自噬[32-33]。上调HMGB1可增加磷脂酰肌醇-3-激酶复合物的形成，并通过与Bcl-2竞争结合Beclin1，刺激自噬体成熟。HMGB1和自噬的抑制增加了体内外骨肉瘤细胞对药物的敏感性，且HMGB1与Beclin1的相互作用需要人类unc-51样激酶1(unc-51-like kinase 1，ULK1)复合物的存在，其相互作用促进磷脂酰肌醇-3-激酶复合体在自噬过程中的形成，提示HMGB1介导的自噬促进了骨肉瘤细胞的耐药[34]。另外，高迁移率族核小体结合的结构域5在骨肉瘤中高表达，特别是在治疗后的肿瘤中。过度表达的高迁移率族核小体结合的结构域5降低了体外骨肉瘤细胞的化学敏感性，并通过上调自噬以及ULK1、Beclin1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的水平增加耐药性[35]。miR-101降低了Atg4的水平，Atg4是两个共轭系统的调节器，在骨肉瘤中可抑制阿霉素诱导的自噬囊泡的形成，并通过miR-101抑制自噬和骨肉瘤细胞对化疗的敏感性[36]。

3 自噬与凋亡的相互作用

自噬在骨肉瘤进展中的确切作用目前尚不清楚。有报道称，自噬既可以促进细胞存活也可以促进细胞死亡[37]。自噬与细胞凋亡密切相关，深入了解自噬，并利用自噬调节细胞凋亡对骨肉瘤的治疗有重要意义。

3.1细胞凋亡与自噬具有协同作用 二氨基吖啶具有剂量依赖性抑制骨肉瘤细胞增殖的作用，并通过协调细胞凋亡与自噬发挥抗癌作用[38]。南蛇藤醇是一种三萜烯药物，具有强效的抗肿瘤作用，其在骨肉瘤细胞中通过活性氧类/c-Jun氨基端激酶信号通路，诱导细胞凋亡和自噬[39]。

3.2自噬与细胞凋亡之间的对抗关系 Beclin1是一种重要的自噬调节蛋白，与许多疾病如癌症、衰老以及退行性疾病相关。Atg6和Beclin1可使肿瘤细胞的生长、侵袭以及转移减少，表明抑制自噬对化疗诱导的细胞毒性有积极作用，增加了抗癌药物的治疗功效[40]。热激蛋白90抑制剂格尔德霉素通过抑制蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/p70S6K信号转导通路，在KTHOS细胞中诱导自噬[41]。在KTHOS细胞中，格尔德霉素也能诱导凋亡蛋白酶依赖性凋亡通路，与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤联合，可增强其诱导的细胞凋亡[41]。在骨肉瘤细胞中，雷帕霉素可抑制细胞增殖，并减少哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路成分磷酸化骨肉瘤细胞，Spautin-1(一种新型自噬抑制剂)可抑制雷帕霉素诱导的保护机制，从而有效诱导了细胞凋亡[42]。 Dihydroptychantol A是一种大环双联苄衍生物，在人类骨肉瘤中可诱导自噬以及与p53途径相关的凋亡。此外，敲除内质网激酶R样蛋白激酶受体可抑制自噬，最终导致骨肉瘤细胞凋亡[43]。

4 结 语

关于细胞凋亡和自噬如何影响骨肉瘤细胞的增殖和侵袭，以及影响骨肉瘤耐药的潜在因素已经探讨了很多，但仍有很多问题需要解决。目前关于骨肉瘤的治疗，耐药是最大阻碍。自噬到底是增强还是降低了骨肉瘤的耐药，目前还尚未研究清楚。此外，细胞自噬与凋亡之间的相互作用很复杂，自噬可提高细胞的生存能力和坏死细胞数量；而细胞凋亡、自噬均可以诱导肿瘤细胞的死亡，但相互作用途径还有待研究，深入了解细胞的自噬与凋亡，也为骨肉瘤的治疗提供新的方法。